基于HPLC方法测定预灌封注射器组合件中丙烯酸浸出量

周光耀，余黛媚，张 怡

(广州伯朗氏检测技术有限公司，广东 广州 510000)

近年来，预灌封注射器(PFS)是兴起的实用、新型注射剂包装容器。相比传统的注射剂瓶橡胶塞的包装系统，PFS具有方便可靠、标识清晰、用药剂量更准确等优点，可减少潜在的医疗事故发生，也可最大限度地减少与药品溢出相关的药物浪费，逐渐成为疫苗、治疗型蛋白类药物的首选容器[1-2]。使用PFS作为药品包装容器时，必须关注其与所含药物产品和相关形式的相容性[3]，以确保患者安全和药物质量，因此了解PFS可提取物和可浸出物(E&L)对于评估毒理学和药物质量风险至关重要。由于蛋白质具有广泛的表面积和更多的潜在相互作用位点，结构复杂，活性与构象变化密切相关，蛋白类生物制品可能更容易受到包装系统中化学浸出物的影响[4]。

PES主要由玻璃针筒、橡胶活塞、注射针、护帽和推杆五部分组成。在PFS加工过程中将针头固定到玻璃筒上需要的粘合剂作用。紫外光UV固化胶是常用的PES粘合剂，而丙烯酸酯类胶粘剂作为常见的UV胶[5]，是以丙烯酸及其酯类为主要原料，与其他物质共聚而制得。根据文献报道，丙烯酸作为丙烯酸粘合剂的化学组分之一，可能浸出至各种配方的蛋白质产品中，通过迈克尔反应，丙烯酸可以在赖氨酸、N-末端和组氨酸三个不同的位置发生相互作用[6]。被从粘合剂浸出的丙烯酸改性后，治疗性蛋白质可能会发生电荷和疏水性的变化，从而导致蛋白质结构和功能的改变[7]，有研究报道了特定蛋白IgG2和浸出的丙烯酸之间的相互作用[8]。可浸出物与蛋白质产品之间的相互作用会导致产品质量变化，尽管这样的变化不会引起即刻的毒理学问题，但是从长期来看，仍然会对患者的安全性产生不利影响，因此，对于特别容易受到化学浸出物影响的治疗性生物蛋白产品，需要使用科学合理的方法对可能影响药品稳定性的浸出物进行评估[9]。预灌封注射器属于高风险输液产品，UV胶长时间接触到药液，所浸出的丙烯酸含量可能会影响针剂药品的质量安全。

因此，本文开发了高效液相色谱法(HPLC)，以水为介质，检测预灌封注射器中丙烯酸的浸出量，该方法具有操作简单、重复性好、灵敏度高的特点。对不同来源的PFS进行提取研究和浸出研究，有效加强高风险产品质量控制，为企业对药包材的选择和适用性评估方面提供参考依据。

1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪带紫外检测器，日本岛津公司(Agilent 1220型)；电子天平(精度为0.01 mg)，德国sartorius公司(BT25S)。

丙烯酸(纯度99.8%)购自德国CNW Technologies GmbH；甲醇购自默克化工技术有限公司(MERCK)；磷酸购自迈瑞达(MREDA)。

预灌封注射器组合件(带注射针)来自A、B厂家。

2 试验方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 供试液的制备

取超纯水1 mL分别灌装至预灌封注射器中，用橡胶活塞密闭后倒置使针头部位向下，置高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃下分别保持0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h。相同的条件下制备不接触预灌封注射器的水提取空白样品。量取经过提取的样品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，用水稀释定容，即得供试液。

2.1.2 对照品溶液配制

精密称取丙烯酸对照品约20.00 mg，使用超纯水溶解得0.2 mg/mL丙烯酸对照品贮备液。逐步稀释得4.00 μg/mL的对照品溶液。

2.2 HPLC分析方法

色谱柱：SHIMADZU C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸：甲醇(体积比为80∶20)；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长220 nm；进样量5 μL。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

取空白提取液、对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1～图2。结果显示丙烯酸的保留时间为3.54 min。空白液图谱中在丙烯酸位置处无明显吸收峰，不干扰测定。加标提取液中基质物质不干扰测定。结果表明该方法专属性好。

图1 对照品溶液色谱图

图2 空白溶液色谱图

2.3.2 线性关系考察

取对照品贮备液，用水稀释至浓度为0.43、2.15、4.30、8.59和17.20 μg/mL的系列浓度溶液，分别进样测定，记录峰面积。以峰面积A为纵坐标，浓度C为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y=13 228.296 07x-125.297 57，r=0.999 8。结果表明，丙烯酸在0.43～17.20 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.3.3 定量限和检测限考察

取对照品溶液，用甲醇逐级稀释至浓度为0.017 μg/mL，信噪比为5.1，即仪器检测限为0.017 μg/mL。取对照品溶液，用甲醇逐级稀释至浓度为0.043 μg/mL，信噪比为13.4，即仪器定量限为0.043 μg/mL。

2.3.4 精密度和稳定性试验

精密吸取对照贮备液1 μL置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制得加标溶液。取适量的对照溶液连续进样6次，记录峰面积。结果显示RSD为0.7%，加标样品的变异系数均小于5%，表明精密度良好。

取加标溶液，分别室温放置0 h、24 h、48 h、72 h进样测试，记录峰面积。结果显示RSD为2.6%，表明丙烯酸在提取基质中72 h内稳定性良好。

2.3.5 回收率试验

精密吸取对照贮备液1 μL、10 μL和20 μL置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制得水的加标溶液。对照贮备液稀释加标浓度分别为2.15 μg/mL、4.30 μg/mL和8.59 μg/mL，每个浓度平行制备3份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定结果见表1。结果显示低、中、高浓度相应的回收率分别为100.1%、99.8%、100.1%，平均回收率为100.0%，回收率的RSD为0.78%。结果表明本方法回收率良好。

表1 加样回收试验结果

2.4 PES中丙烯酸提取量的测定

按“2.1.1”和“2.1.2”项下方法分别制备供试品及对照溶液，按“2.2.1”项下色谱方法进样测试，以外标曲线法计算供试品溶液中丙烯酸含量，结果见图3。结果显示随着提取时间的延长，丙烯酸的提取量增加，提取时间为0.5～2 h内提取量明显增加，2 h以后提取量增长速度放缓，趋于稳定。

图3 不同提取时间PFS中丙烯酸的提取量

2.5 加速条件下丙烯酸的浸出量

采用水作为水基性药品的模拟液，相对于室温存储，在提高接触温度的条件下测试预灌封注射器中丙烯酸的浸出量。测试对象为不同厂家(A、B厂家)来源的预灌封注射器，各取三批次预灌封注射器，灌装纯化水1 mL，用橡胶活塞密闭后倒置使针头部位向下，置于鼓风干燥箱中，温度分别设置为40 ℃和60 ℃，于10天和30天取样。同法放置不接触预灌封注射器的水作为空白样品。

按“2.1.1”和“2.2.2”项下方法分别制备对照品及供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱方法进样测试，以外标曲线法计算供试品溶液中丙烯酸浸出量，结果见表2。结果表明，不同厂家来源的预灌封注射器中丙烯酸浸出量有明显差异。

表2 加速条件下丙烯酸的浸出量

3 讨 论

在本研究建立了一种高效液相色谱法，用于检测来源于预灌封注射器针头粘合剂中浸出的丙烯酸。该方法准确性高，线性关系良好。通过测定不同时间点的丙烯酸可提取量，综合考虑提取效率和时间成本，121 ℃下高压蒸汽灭菌2 h为初步筛选预灌封注射器的适宜提取条件。在对不同厂家的预灌封注射器在加速条件下进行考察后，试验结果表明不同来源的注射器中丙烯酸浸出量存在明显差异。

丙烯酸对皮肤、眼睛和粘膜具有强烈的刺激性，但目前尚无关于丙烯酸对人类生殖、发育或致癌作用的确切信息[10-11]。动物癌症研究报告了阳性和阴性结果，美国环境保护署(EPA)未将丙烯酸归类为致癌物质，属于国际癌症研究机构第IARC 3类物质。推荐的丙烯酸口服参考剂量(RfD)为0.5 mg/kg/天[12](来源于美国环保署(EPA)的综合风险信息系统)。从口服途径推导至肠胃外给药途径乘以10%[13]，体重以50 kg计，丙烯酸肠胃外给药途径的每日暴露量为2.5 mg/day。本研究检测的丙烯酸浸出量远低于该每日暴露量，安全性风险较低。但可浸出的丙烯酸可引起蛋白质改性。据报道[14]，当可浸出丙烯酸浓度约为5 μg/mL时，约0.02%～0.3%的蛋白质会被丙烯酸改性，这会对蛋白质浓度较低的治疗性生物制剂产生不可忽视的影响。而且需要注意，随时间推移，浸出的丙烯酸量会不断累积，导致在长期储存中存在更多的蛋白质被修饰而失效的风险。

鉴于生物制药的特殊性，选择药品包装材料时应特别注意避免其浸出物与蛋白质药品之间的相互作用，确保产品质量。预灌封注射器中可提取物和浸出物的相关指导原则对PFS系统相容性研究具有一定的借鉴作用，在国内外缺乏丙烯酸的相容性研究标准的情况下，全面地探究影响丙烯酸提取的关键因素对后续研究有一定的指导作用。

4 结 论

本研究建立的HPLC方法简便，准确，可靠，可适用于检测预灌封注射器组合件浸出物中丙烯酸的含量。