基于LC-MS法对不同提取条件下生物反应袋中bDtBPP含量分析

余黛媚，张 怡，周光耀，李月菊

(广州伯朗氏检测技术有限公司，广东 广州 510000)

近年来，一次性使用系统(Single-Used System，SUS)在生物制药领中得到广泛应用。该系统专为单次使用或单一产品生产而设计的生物加工设备，特别适用于涉及动物细胞培养的工艺，如治疗性抗体、激素、重组蛋白、酶和疫苗的生产。一次性系统具有建设周期短、组装灵活、成本低廉、生产效率高和可避免交叉污染等优点，是生物医药生产的重要创新。一次性生物反应袋(Single-Used Bags，SUBs)代表了生物制药生产中的一个重要改进，在新工艺开发和中试规模生产中有广泛的应用。

为保证其性能与稳定性，用于生产反应袋的高分子聚合物需添加抗氧化剂、润滑剂、增塑剂、澄清剂和稳定剂等添加剂。根据USP PF <665>[1]，这些添加剂或其相关化合物、降解产物将在与液体接触时从系统中溶出，作为与工艺设备相关的浸出物(PERL)进入工艺流体中，可能会以浸出物形式存在于最终药品中。因此，在使用一次性系统的同时也面临新的挑战，例如潜在的有毒或抑制性浸出物从系统中释放，进入工艺流体(如含细胞的培养基)而导致细胞生长抑制、昂贵细胞株丢失和产量下降等问题。浸出物带来的风险是生物医药企业面临的重要课题，各国监管部门出台方案、法规和指南[2-3]，提出了对可提取物和浸出物(E&L)的风险评估思路和研究策略。生产企业和申请人作为主要责任方，须确保所采用一次性系统符合预期用途。

一次性生物反应袋(SUBs)在某些处理条件或在最差条件下，接触层材料中溶出的化合物可能导致药品的有效性下降，是一次性系统的主要缺点之一。塑料添加剂抗氧剂168的降解产物双(2，4-双叔丁基苯基)磷酸酯(bDtBPP，CAS 69284-93-1)被认为是一种溶出物[4]，对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株系具有细胞毒性[5-6]，目前尚无标准化的操作规程对bDtBPP的溶出行为进行测试。

本文采用高效液相色谱-质谱联用技术测定提取液中bDtBPP的含量，该方法具有高灵敏度和高选择性的特点，降低了假阳性检测结果的出现概率。通过考察不同的前处理方式和提取条件对bDtBPP可提取量的影响，探讨影响bDtBPP释放行为的因素，为生物制药过程中如何科学选择SUBs提供了参考。

1 仪器、试剂与材料

仪器：AB SCIEX 4000高效液相-三重四级杆串联质谱联用仪，美国AB SCIEX公司；电子天平，德国sartorius公司(精度为0.01 mg)。

试剂：双(2，4- 双叔丁基苯基)磷酸酯(69284-93-1，纯度98.0%)，上海昶衍化工科技有限公司；氨水、甲醇(均为质谱纯)，阿拉丁；无水乙醇(色谱纯)，迈瑞达(MREDA)。

一次性生物反应袋(国外A厂家提供)，为多层高分子生物膜，膜材内表面液体接触层材质为低密度聚乙烯(LDPE)。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 供试液制备

50%乙醇作为提取溶剂，使得袋子内表面积与提取溶剂体积的比例约为6 cm2/mL，称重。将灌装提取溶剂的袋子置于水浴震荡器中后设置水浴温度，震荡频率60 rpm。提取结束后拭干袋子表面后称重，提取前后的重量损失不得超过20%。

取50%乙醇灌装至玻璃试剂瓶中密闭，采用相同的提取条件，制备不接触袋子的空白提取液。

样品溶液经0.2 mm滤膜过滤后即为供试液。

2.1.2 对照品溶液配制

精密称取bDtBPP对照品20.38 mg，用甲醇溶解得浓度为0.2 mg/mL bDtBPP对照品贮备液。使用甲醇逐级稀释后得0.50 μg/mL的对照品溶液。

2.2 LC-MS分析方法

2.2.1 色谱条件

ACE Excel 3 C18-AR色谱柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流动相：A为0.05%积比)氨水溶液，B为0.05%(体积比)氨水甲醇。梯度洗脱程序：0～4.0 min，B由90%升至100%；4.0～6.0 min，B为100%；6.0～6.1 min，B由100%降至90%；6.1～13.00 min，B为90%；流速0.5 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.2.2 质谱条件

点喷雾离子源(ESI)，负离子模式，多反应检测(MRM)模式；雾化气为空气，气体压力为55 psi；干燥气温度为300 ℃；雾化气压力50 psi；喷雾针电压 -4 500 V；母离子 473.2 Da，子离子205.2 Da；解簇电压(DP)-130 V；碰撞能量(CE)-60 V。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

取提取空白、对照品溶液注入高效液相-三重四级杆串联质谱联用仪。待测物bDtBPP的保留时间为2.14 min。提取空白液图谱中在bDtBPP位置处无明显吸收峰，不干扰测定，见图1和图2。

图1 空白溶液的LC-MS图谱

图2 对照品溶液的LC-MS图谱

2.3.2 系统适用性试验

取2.1.2对照品溶液按“2.2”项下仪器条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积，计算得RSD为2.1%。

2.3.3 线性试验

取对照品贮备液2，用甲醇稀释至浓度为0.13、0.50、2.52、5.04、10.08和20.16 μg/mL 的系列浓度溶液，分别进样测定，记录峰面积。以峰面积A为纵坐标，浓度C为纵坐标，进行线性回归，得回归曲线为A=1 137.342 71x+ 406.641 46，r=0.999。结果表明，bDtBPP在0.13～20.16 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度和稳定性试验

精密吸取对照贮备液制得加标溶液，平行制备6份，按照方法进行检测，计算峰面积的RSD为1.4%，加标样品的变异系数均小于5%，结果表明精密度良好。

取上述加标溶液，室温放置，分别于0 h、24 h、48 h、72 h进样测试，计算峰面积的RSD为4.2%，表明bDtBPP在提取基质中72 h内稳定性良好。

2.3.5 回收率试验

精密吸取对照贮备液用50%乙醇稀释成浓度分别为0.50 μg/mL、2.5 μg/mL和10.0 μg/mL的加标溶液，平行制备3份，进样测定。结果显示低、中、高浓度相应的回收率分别为102.0%、100.1%、98.9%，每个浓度点回收率的RSD为0.5%、1.0%、0.2%。结果表明本试验方法的回收率良好。

2.3.6 检测限与定量限

取对照品贮备液，用甲醇逐级稀释至浓度为0.007 μg/mL，信噪比为6.6，即仪器检测限为0.007 μg/mL。用甲醇逐级稀释至浓度为0.02 μg/mL，信噪比为12.8，即仪器定量限为0.02 μg/mL。

2.4 样品的检测

2.4.1 不同灭菌方式对bDtBPP提取量的影响

在提取试验前采用伽玛射线辐照灭菌(辐照强度为25 kGy)、环氧乙烷灭菌和湿热灭菌(121 ℃下处理30 min)的方式对袋子进行处理。取灭菌后袋子，设置提取温度为40 ℃，提取时间为48 h，按“2.1.1”项下方法分别制备供试液进样测试，进样测试，记录峰面积，以外标法计算提取液中bDtBPP含量(μg/mL)，结果见表1。结果显示环氧乙烷灭菌和湿热灭菌的灭菌方式下，未检出bDtBPP含量，在玛射线辐照的灭菌方式下bDtBPP含量为0.23 μg/mL。结果表明在伽玛射线辐照下的灭菌方式可用于提取bDtBPP。

表1 不同灭菌方式对bDtBPP的提取量的影响

2.4.2 不同提取温度对bDtBPP提取量的影响

在提取试验前采用伽玛射线辐照对袋子进行处理，辐照强度选择常见的25 kGy。设置提取温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃，提取时间为48 h，按“2.1.1”项下方法制备供试液，进样测试，记录峰面积。以外标法计算提取液中bDtBPP含量，结果见表2。结果显示30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下bDtBPP提取量分别为0.16、0.23、0.42、0.70 μg/mL。结果显示在30～60 ℃范围内，bDtBPP提取量随着温度的增加而提高。

表2 不同提取温度对bDtBPP提取量的影响

2.4.3 不同提取时间对bDtBPP提取量的影响

在提取试验前采用伽玛射线辐照对袋子进行处理，辐照强度选择常见的25 kGy。设置提取温度为40 ℃，分别于1、2、5、7、14和21天取样，按“2.1.1”项制备供试液，进样测试，记录峰面积，以外标法计算提取液中bDtBPP含量，以提取时间(天)对应提取量作图，结果见图3。结果显示1～7天内，bDtBPP的提取量迅速增加，7天后bDtBPP的提取量增加速度变慢。结果表明1～21天范围内，bDtBPP的提取量随着提取时间的增加而提高。

图3 不同提取时间对bDtBPP提取量的影响

3 结 论

本研究采用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)测定提取液中抗氧剂168的降解物双(2，4-双叔丁基苯基)磷酸酯(bDtBPP)的含量。该方法具有高灵敏度和高选择性，在0.13～20.16 μg/mL范围内线性关系良好。本研究考察不同前处理条件和提取条件对bDtBPP可提取量的影响，探讨影响其释放行为的因素。

本研究结果显示，采用未经辐照灭菌的样品提取，提取液中未检出bDtBPP，与文献报道一致[7]，表明暴露于辐射是形成可提取bDtBPP的必要条件。抗氧化添加剂Irganox 168是聚烯烃配方中常用的辅助抗氧剂，作用是使聚合物在高温加工或电离辐射过程中可能产生的过氧化氢失活[8]。在该过程中，Irganox 168被氧化生成Irganox 168磷酸盐[9]，在辐照条件下，bDtBPP由Irganox 168磷酸盐生成。

考虑到双(2，4-双叔丁基苯基)磷酸酯(bDtBPP)从一次性生物反应袋中溶出会对细胞生长产生显著影响，本研究探索了影响其溶出速度的因素。可提取物的积累通常受热力学与动力学因素控制[10]，温度与时间是溶出的驱动力及关键影响因素。本研究结果表明随着提取温度升高，bDtBPP的提取量增加。同时，研究结果显示，在40 ℃提取温度下，随着提取时间延长，bDtBPP的提取量增加，开始时增加速率较快，7天后增加速率减缓，14天后逐渐达到平衡。膜材与提取液中bDtBPP的最终平衡浓度受两相(聚合物材料与液体)之间分配系数控制，假设膜材接触层含一定量bDtBPP且不随时间增加，则在最开始的提取时间段内，bDtBPP向袋子内液体的转移速率较快，速率限制步骤为聚乙烯层扩散至聚乙烯/流体界面。随时间推移，bDtBPP逐渐消耗，液体中累积量基本稳定。

一次性生物反应袋(SUBs)中的浸出物可能对最终制品产生潜在的毒性或抑制性影响。本研究结果为生物制药过程中一次性使用系统的选择与质量控制提供了重要参考。尽管本研究着重探讨了(bDtBPP)对生物制药过程的影响，但还需进一步研究评估其他可浸出物对生产过程与产品质量的影响。

综上，本研究结果表明，温度、时间和灭菌处理过程是影响bDtBPP从一次性生物反应袋中溶出的关键因素。