广叶绣球菌多糖对铅致小鼠骨骼钙代谢紊乱的调节作用

乔泽宁，翟 晨，曹谨玲，云少君，程艳芬，程菲儿，冯翠萍

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

铅是一种环境中普遍存在的有毒重金属，由于铅在环境中不可降解且长期蓄积，其可通过水、空气、土壤和食物链进入人体[1]。铅进入机体后，约95%蓄积在骨骼之中，影响骨骼的新陈代谢和功能发挥，铅中毒与骨骼发育畸形、骨质疏松、骨关节炎等多种疾病密切相关[2]。铅可以取代机体内钙、锌、铁二价矿物元素的位置，从而影响其他二价矿物元素的代谢，破坏其在机体内的平衡[3-4]。铅可以作为钙离子的类似物，直接影响钙代谢并阻碍骨骼发育，还可以通过间接途径影响骨代谢，主要表现为对一些与骨代谢有关激素的影响[5-7]。并且铅在骨骼中的沉积还会对其形态结构、硬度、体积和厚度等产生影响，对骨骼造成损伤[8-9]。目前，对铅中毒的治疗主要是利用螯合剂，如乙二胺四乙酸盐和二巯基琥珀酸等，但同时会带来一系列的副作用[10]。

通过摄入天然食品组分，进而对铅进行干预是预防慢性铅损伤的发展趋势。孟静等[11]利用荧光定量PCR技术检测了骨骼TRPV通路相关基因，发现适量钙的补充可减轻铅暴露对骨骼TRPV通路的干扰。李茜[12]研究表明，杏鲍菇多肽能够显著降低骨骼中铅含量，调控TRPV通路相关基因的表达，从而改善染铅导致的大鼠骨骼损伤。多糖是构成生命的四大基本物质之一，具有广泛的生物学效应，还能直接影响机体的物质和能量代谢[13-14]。姬松茸多糖[15]、海藻多糖[16]等均有促进排铅的作用，但是多糖对染铅小鼠骨骼钙代谢的影响还鲜少报道，并且多糖的促排铅作用与骨骼钙代谢之间的联系还有待进一步研究。

广叶绣球菌（Sparassis latifolia）是一种珍稀的食药用菌，多糖含量可达39.3%～43.6%，为菇类之最[17-18]。研究表明，广叶绣球菌多糖（Sparassis latifoliapolysaccharides，SLPs）具有免疫调节[19]、抑菌[20]、降血脂[21]、抗炎症[22]和抗氧化[23]等作用。山西农业大学食品科学与工程学院食品营养与安全课题组前期对广叶绣球菌多糖的结构进行了研究，结果表明，分离纯化广叶绣球菌多糖后，可以得到一种分子质量为6456 u、主链为β-（1→3）-D-葡聚糖、支 链 为β-（1→6）-D-葡聚糖的β-葡聚糖[24]。基于此，本试验以染铅小鼠模型为基础，通过研究小鼠骨骼中二价矿物质元素的含量、钙代谢相关激素和酶水平、骨组织形态以及钙代谢相关基因表达情况的影响，进而探究SLPs对染铅小鼠骨骼钙代谢的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料及动物

供试广叶绣球菌由清徐县太和食用菌栽培基地提供。

3周龄SPF级雄性昆明小鼠，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010，饲养于山西农业大学试验动物管理中心，许可证号：SYXK（晋）2020-0003。试验饲料、垫料及动物饮水等均符合SPF级动物使用标准。

1.2 主要试剂及仪器

EDTA脱钙液：EDTA-2Na 100 g加PBS缓冲液（pH值7.2）至1000 mL，加NaOH （10～15 g）搅拌溶解后用1 mol/L HCl调pH值为7.2～7.4。配置液经高温杀菌后使用。

BGP、PHT、CT酶联免疫吸附检测试剂盒（上海江莱生物公司）；AKP试剂盒、总蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；苏木精染液、伊红染液（山西百奥生物科技有限公司）；切片石蜡（上海华申康复器材有限公司）；中性树胶（北京索莱宝科技有限公司）；RNAiso Plus试剂盒、Prime ScriptTMRT Master Mix试 剂 盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（TaKaRa公司）；引物合成（太原奥科鼎盛生物公司）；醋酸铅、氯化钠、柠檬酸钠等均为国产分析纯。

GD12 石墨消解仪（奥普乐仪器有限公司）；Optima5300 DV型电感耦合等离子发射光谱仪（美国PE公司）；切片机、展片机、摊片机（徕卡显微系统（上海）贸易有限公司）；IX3显微镜（北京顺能电子仪器有限公司）；-80 ℃冰箱（日本松下公司）；5417-R高速冷冻离心机、5804 R型高速低温台式离心机、核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf股份公司）；Mx3000P荧光定量PCR仪（美国Stratagene公司）；SpectraMax i3x多功能酶标仪（美谷分子仪器（上海）有限公司）；MyCyclerTMThermal Cycler PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 SLPs的提取 根据山西农业大学食品科学与工程学院食品营养与安全课题组前期方法[25]提取广叶绣球菌多糖，将广叶绣球菌子实体置于35 ℃烘箱中干燥，切片粉碎并过0.074 mm筛，按照1∶40 （g/mL）的料液比添加蒸馏水，搅拌均匀，75 ℃水浴3 h后，5000 r/min离心15 min，旋蒸浓缩上清液至黏稠状，加入3倍体积无水乙醇混匀后，4 ℃过夜，5000 r/min离心10 min收集沉淀，用丙酮和乙醚清洗沉淀直到洗液澄清，将沉淀用适量蒸馏水溶解后加入适量中性蛋白酶45 ℃水浴8 h并定时搅拌，灭酶后再次离心，取上清加入1/3体积Sevage溶剂（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1），磁力搅拌30 min，离心取上层溶液并反复操作，用大孔树脂纯化后真空冷冻干燥后得到广叶绣球菌多糖，苯酚硫酸法测定广叶绣球菌多糖的纯度为88.3%。

1.3.2 动物模型的建立和样品采集 将70只3周龄的SPF级雄性昆明小鼠，在恒温（（25±0.5）℃）、恒湿（50%±5%）的环境下适应性喂养7 d后，随机分为5组：对照组（NC）、染铅组（Pb）、低剂量多糖组（100 mg/kg·bw，L-SLPs）、中剂量多糖组（200 mg/kg·bw，M-SLPs）、高剂量多糖组（400 mg/kg·bw，H-SLPs），每组14只，均给予普通饲料，NC组给予去离子水，其余各组给予1.84 g/L醋酸铅溶液。SLPs低、中、高剂量组小鼠每天灌胃一次，灌胃量根据小鼠当天的体质量计算，空白组和染铅组每天灌胃等量生理盐水。期间小鼠自由饮水摄食，记录小鼠每天的体质量变化情况。饲养56 d后，采集骨骼组织称质量。一部分右侧股骨浸泡于4%多聚甲醛溶液中用作骨骼切片，其余在液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.3.3 SLPs对染铅小鼠骨骼中二价矿物质元素含量的影响 参考GB 5009.12—2017标准[26]测定小鼠骨骼中二价矿质元素Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+的含量。取约0.2 g骨骼，称质量后放于加有玻璃珠的消化管中，加入10 mL的浓硝酸和0.5 mL的高氯酸，室温静置过夜，于石墨消解仪上进行消化，待消化液澄清透明后用1%稀硝酸定容至10 mL即为待测样品。使用电感耦合等离子发射光谱仪测定待测样品中Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+的含量。

1.3.4 SLPs对染铅小鼠骨代谢相关激素和酶含量的影响 按照甲状旁腺激素（PTH）、骨钙素（BGP）、降钙素（CT）及碱性磷酸酶（AKP）试剂盒说明书测定。

1.3.5 SLPs对染铅小鼠骨骼组织形态的影响 将小鼠股骨置于4%的多聚甲醛溶液中浸泡48 h后，用PBS缓冲液水洗5次，修整、去除多余肌肉组织后，将固定好的股骨置于EDTA脱钙液中脱钙，脱钙液3 d一换，最少1个月，以大头针可穿过时即可。将脱钙后的股骨取出，自来水冲洗过夜后，经乙醇梯度脱水、二甲苯中透明、浸蜡和石蜡包埋后，固定于切片机切成厚度为4 μm的组织片（靠近胫骨端1/3处进行冠状纵切）。摊片、烤片后进行HE染色，使用显微镜观察骨骼组织结构的变化并拍照。

1.3.6 SLPs对染铅小鼠骨骼钙代谢相关基因表达量的影响 称取100 mg骨骼组织，放到预先冷冻在-80 ℃的研钵中，立即加入液氮，加速研磨成粉末后转移至1.5 mL EP管中，并加入1 mL RNAiso Plus，按照试剂盒说明书提取总RNA，使用核酸蛋白仪测定RNA浓度。按照Prime ScriptTMRT Master Mix说明书将RNA逆转录成cDNA。使用TB Green®Premix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒在荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，反应体系为：1 μL cDNA、5 μL TB Green®Premix ExTaqⅡ、上游引物与下游引物各0.4 μL、3.2 μL ddH2O。反应条件为：95 ℃ 90 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s进行45个循环，每组重复3次。以β-actin为内参基因，通过2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。具体引物信息如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.4 数据处理与分析

试验所得数据使用SPSS 23.0进行统计学分析，采用one-way ANOVA和Duncan检验进行多组样本间的差异显著性分析，试验结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，利用 Graphpad prism 8.0.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 SLPs对染铅小鼠体质量变化的影响

从图1可以看出，在饲养56 d时间里，各组小鼠体质量均呈现增长趋势。并且在同一时间内，各组小鼠之间体质量差异不显著（P>0.05）。

图1 SLPs对染铅小鼠体质量变化的影响Fig.1 Effects of SLPs on weight in lead contaminated mice

2.2 SLPs对染铅小鼠骨骼Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+含量的影响

SLPs对染铅小鼠骨骼组织Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+含量的影响如图2所示。

图2 SLPs对染铅小鼠骨骼组织Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+含量的影响Fig.2 Effects of SLPs on the contents of Pb2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+，and Mg2+ in bones of lead contaminated mice

从图2可以看出，与对照组相比，染铅组骨骼组织中Pb2+含量升高了3948.78%，差异达极显著（P<0.01），Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+含量分别降低了27.04%、43.00%、55.04%、72.34%，差异达极显著（P<0.01），Mg2+、Zn2+含量下降，但差异不显著。与染铅组相比，高剂量SLPs组Pb2+含量降低了21.66%，差异显著（P<0.05），Ca2+含量升高了26.65%，差异极显著（P<0.01）；中剂量SLPs组Fe2+含量升高了40.74%，差异极显著（P<0.01）；低、中、高剂量SLPs组在骨骼组织中Cu2+、Zn2+、Mg2+含量上升，但差异不显著。

2.3 SLPs对染铅小鼠钙代谢相关激素含量和酶活性的影响

由图3可知，与对照组相比，染铅组骨骼中PTH含量升高了10.61%，差异极显著（P<0.01），BGP、CT含量和AKP活性分别下降了12.42%、15.25%和26.03%，差异极显著（P<0.01）；与染铅组相比，各剂量SLPs组骨骼中PTH含量均有所下降，其中，高剂量SLPs组PTH含量降低了8.63%，差异显著（P<0.05），低、中、高剂量SLPs组骨骼中BGP含量均有所上升，但差异不显著，中、高剂量SLPs组骨骼中CT含量分别升高了7.73%和11.11%，差异极显著（P<0.01），高剂量SLPs组AKP活性升高了25.54%，差异显著（P<0.05）。

2.4 SLPs对染铅小鼠骨骼组织形态的影响

SLPs对染铅小鼠股骨组织形态的影响如图4所示。

图4 SLPs对染铅小鼠股骨组织形态的影响（HE，×150）Fig.4 Effects of SLPs on the femur histomorphology in lead contaminated mice（HE，×150）

由图4可知，对照组的股骨组织切片中的骨小梁正常，呈网状结构，光滑饱满、粗细一致，骨细胞分布均匀，清晰可见，可见正常的髓腔；染铅组的骨小梁稀疏不均，分布紊乱，部分区域骨小梁出现中断甚至消失，且骨小梁边缘出现了陷窝。与染铅组相比，高剂量SLPs组的骨小梁分布较均匀，骨小梁边缘陷窝较少，可见部分正常的髓腔。

2.5 SLPs对染铅小鼠骨骼中钙代谢相关基因表达量的影响

从图5可以看出，与对照组相比，染铅组小鼠骨骼组织中TRPV5、TRPV6和NCX1mRNA表达量分别下降了90.81%、73.03%和44.68%，差异极显著（P<0.01），PMCA1bmRNA表达量升高了157.75%，差异极显著（P<0.01）。与染铅组相比，高剂量SLPs组中TRPV5mRNA表达量升高了439.59%，差异极显著（P<0.01）；高剂量SLPs组PMCA1bmRNA表达量下降了63.79%，差异极显著(P<0.01)；中、高剂量SLPs组中TRPV6mRNA表达量分别升高了90.53%和116.06%，差异极显著（P<0.01），各剂量SLPs组NCX1mRNA表达量均有上升，但差异不显著（P>0.05）。

图5 SLPs对染铅小鼠骨骼中TRPV5、TRPV6、PMCA1b和NCX1 mRNA相对表达量的影响Fig.5 Effects of SLPs on the relative expression levels of TRPV5，TRPV6，PMCA1b and NCX1 mRNA in bones of lead contaminated mice

3 结论与讨论

铅是一种有毒重金属，由于其不可降解，很容易通过食物链沉积在人和动物体内，从而对血液、肠道、免疫、骨骼等系统造成危害[27-29]。本试验结果表明，与对照组相比，染铅组小鼠骨骼中铅含量极显著升高，说明铅暴露引起小鼠骨骼中铅的蓄积，也证明了本试验造模成功。同时铅引起小鼠骨骼中钙、铁、铜、锰元素失衡，这可能是由于Pb2+与这些二价元素共用一个离子通道并存在竞争拮抗作用，且铅与骨骼组织的亲和性更强[4]。而染铅小鼠在摄入SLPs后可有效调节骨骼中铅、钙、铁含量，其机制可能是多糖以分子形式进入机体，提供氨基、硫酸基等官能团与铅结合促进铅的排出，同时SLPs与Ca2+、Fe2+等形成复合物从而抑制肠腔吸收，进而影响钙、铁的代谢，但其具体作用机制还有待探究[3,30]。

PTH是调节机体内钙、磷平衡的重要激素之一，CT是PTH的拮抗物，可降低血钙，促进骨细胞向成骨细胞转化，降低破骨细胞活性和数量，从而促进骨骼的生长发育[31-32]。BGP和AKP均由成骨细胞合成，BGP会与Ca2+结合促进骨矿化，二者常用来评价成骨细胞生成骨质情况[33]。本研究发现，铅可显著降低小鼠骨骼中BGP、CT含量和AKP活性，显著升高PTH含量，与李茜[12]的研究结果一致。AKP活性的降低可能是由于体内微量元素失衡引起的。铅暴露导致的骨骼中BGP含量和AKP活性的降低，使成骨细胞凋亡增加，从而影响骨的矿化和成骨细胞正常功能的发挥，对骨骼造成了损伤，表现为骨小梁稀疏不均，分布紊乱，且骨小梁边缘出现了陷窝。同时，机体钙含量的降低促进了PTH的合成和分泌，以维持机体钙平衡[34]。CT与PTH拮抗，CT含量降低，减缓生骨细胞向成骨细胞转换的过程，破坏了机体正常骨形成和代谢。而高剂量SLPs可以有效逆转这种趋势，缓解铅致骨骼系统功能的失衡，维持机体的骨代谢平衡，改善铅致小鼠骨组织结构的损伤，使骨小梁分布更均匀，骨小梁边缘陷窝较少。

TRPV5及TRPV6与钙离子代谢有关，在肠道、肾脏、骨骼等器官中均有表达，NCX1和PMCA1b是细胞内钙离子运出相关的通道[35-37]。本试验结果表明，与对照组相比，染铅组的TRPV5、TRPV6和NCX1mRNA表达量均极显著下降，而PMCA1bmRNA表达量极显著上升，以前的研究[11]支持本研究的结果。TRPV5和TRPV6mRNA表达量的下降，可能是由于TRPV5、TRPV6通路具有高度的钙选择性，当细胞外钙离子浓度较低时，受到钙依赖性反馈调节的作用，将钙离子向细胞内转运。同时，染铅小鼠骨骼中铅取代钙主要以磷酸铅的形式蓄积，为维持机体内骨钙和血钙平衡，骨骼组织中的钙释放进入血液，钙的排出量增大，使PMCA1bmRNA表达量上升。而在PMCA1bmRNA表达量极显著上升的同时NCX1mRNA表达下降，二者之间在转运运出钙过程中的具体机制还有待进一步研究。染铅小鼠摄入SLPs后，上调了TRPV5及TRPV6mRNA的表达量，促进了机体对钙离子的吸收，增加了骨骼的钙含量，而骨钙的增加减少了钙向血液流动，PMCA1bmRNA表达量下调，使骨骼组织对钙的运出减少。

综上，SLPs可以促进机体对铅的排泄，降低骨骼中铅的含量，改善骨骼钙铁元素失衡，使骨骼中PTH水平降低、CT含量和AKP活性提高，同时会提高钙离子向细胞内转运通道TRPV5和TRPV6mRNA表达量，使细胞内吸收的钙离子增加。钙离子进入细胞后，钙结合蛋白会与其立即结合，将钙离子转运至基底外侧膜，并通过PMCA1b将钙离子转运出细胞外。SLPs降低了PMCA1bmRNA表达量，减少了钙离子向细胞外转运，从而提高了骨骼中钙离子的含量，促进骨骼的生长发育，有效缓解了铅致小鼠骨骼组织结构的损伤，调节小鼠骨骼钙代谢紊乱。

本研究表明，铅暴露导致小鼠骨骼中铅蓄积，降低了Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+元素含量、BGP、CT含量和AKP活性，升高了AKP含量；小鼠骨骼组织结构损伤，骨小梁稀疏不均，分布紊乱，TRPV5、TRPV6和NCX1mRNA表达量下调，PMCA1bmRNA表达量上调。而SLPs可以逆转这种趋势，能够促进机体对铅的排泄，降低骨骼中Pb2+的含量，提高骨骼中Ca2+和Fe2+的含量，有效改善铅致骨骼中钙铁元素失衡，降低骨骼中PTH水平，提高CT含量和AKP活性，从而促进骨骼的生长发育，有效缓解铅对小鼠骨组织结构的损伤，促进TRPV5、TRPV6mRNA表 达，抑 制PMCA1bmRNA表达，调控钙代谢相关基因，提示SLPs可有效缓解铅致小鼠骨骼钙代谢紊乱。