FTO及其抑制剂对DLBCL利妥昔单抗耐药的影响

顾季炜,施 梅,宋国齐

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是起源于生发中心的,是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma,NHL)中最常见的一种类型[1]。利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(rituximab,cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,and prednisone,R-CHOP)方案大约能治愈60%的DLBCL患者,其余患者则会出现难治或复发[2]。因此,研究利妥昔单抗获得性耐药的机制具有重大意义。m6A是腺苷N6位发生甲基化,是一种转录后修饰,在癌症发生、发展及耐药中发挥重要的作用[3]。研究[4]表明,MYC基因易位相关的 DLBCL与 R-CHOP 治疗的低生存率相关,这表明MYC可能与DLBCL利妥昔单抗耐药存在相关性。脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是一种去甲基化酶[5],在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中R-2-羟基戊二酸(R-2-hydroxyglutarate,R-2HG) 通过靶向FTO/m6A/MYC/CEBPA 信号传导,抑制了癌细胞增殖,发挥抗肿瘤作用[6]。甲氯芬酸钠(meclofenamic acid,MA)可结合 FTO 的活性表面,选择性抑制 FTO 介导的 m6A去甲基化,减少胶质母细胞瘤干细胞的增殖[7]。该研究旨在探讨FTO及其抑制剂MA通过MYC、CEBPA影响DLBCL利妥昔单抗的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);健康人血浆(南通大学附属医院健康体检者);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、CCK-8试剂盒(日本DojinDo公司);AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);利妥昔单抗注射液(上海罗氏制药有限公司);兔抗人FTO单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司);兔抗人c-Myc单克隆抗体、兔抗人CEBPA单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology 公司);引物由广州市锐博生物技术有限公司设计及合成;Trizol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);酶联仪(美国Biotek公司);流式细胞仪(美国BD公司);蛋白免疫印迹电泳设备及化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司);QuantStudio5荧光定量PCR 仪(美国Thermofisher 公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞来源与培养 选取2种“双重打击”淋巴瘤衍生的细胞系,活化B细胞样(ABC型)OCI-LY8(LY8)和生发中心B细胞样(GCB型)OCI-LY18(LY18),均购自中国科学院细胞库上海保藏中心。取生长状态良好的细胞系,培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640完全培养基中,置于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养,观察细胞培养基颜色及显微镜下密度,及时换液和传代。

1.2.2耐药细胞株模型的建立 采用梯度加药法诱导DLBCL细胞系的耐药,分别将处于生长对数期的细胞系LY8、LY18以0.5×106个/ml的密度接种于含10%新鲜人血浆的RPMI-1640培养基中,加入0.5 μg/ml利妥昔单抗,12 h后换正常完全培养基培养至细胞状态恢复正常(约4～5 d),在下个周期将利妥昔单抗浓度提高到前1个周期的2倍,按此方式重复9个周期后,得到对128 μg/ml利妥昔单抗耐药的细胞株(LY8R、LY18R)。

1.2.3CCK-8法检测细胞存活率 将亲本及耐药细胞株分别接种于96孔细胞培养板中,每孔细胞5×104个,分别加入浓度为0、2、10、50、100 μg/ml利妥昔单抗,每个平行样本3个副孔,孵育48 h后按所提供的实验步骤在酶联仪上测450 nm波长处的吸光度值,计算细胞存活率。将耐药细胞株及经MA[根据药物说明书MA的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为5.6×10-6mol/L]处理后的耐药细胞株分别接种于96孔细胞培养板中,每孔细胞5×104个,每个平行样本3个副孔,孵育48 h后,按实验步骤在酶联仪上测450 nm波长处的吸光度值,计算细胞存活率。

1.2.4流式细胞术检测调亡 将亲本及耐药细胞株均分为2组: 0 μg/ml和50 μg/ml利妥昔单抗组,每组3个复孔,于细胞培养箱内,48 h后收集细胞,1 000 r/min离心5 min,PBS洗3次,Binding Buffer重悬细胞,分别加入FITC-AnnexinV和PI各5 μl,避光孵育20 min。BD流式细胞仪检测细胞凋亡率, FlowJo 软件进行统计分析。

1.2.5RT-qPCR测定FTO表达 收集2×106～3×106个细胞,提取总RNA,参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA,采用RT-qPCR检测各组FTO的表达情况,引物序列由广州锐博生物技术有限公司设计及合成,引物序列见表1 。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6Western blot检测 收集亲本及耐药细胞,提取总蛋白,并进行BCA蛋白定量分析。SDS-PAGE电泳,随后将蛋白转至PVDF膜上,转膜结束后用5%脱脂牛奶封闭2 h。分别加入FTO抗体(1 ∶1 000)、c-Myc抗体(1 ∶1 000)、CEBPA抗体(1 ∶1 000)及GAPDH抗体(1 ∶1 000) 4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10 min,结束后分别加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)室温避光孵育2 h,TBST洗膜5次, ECL化学发光法显影,Image J测量条带灰度值。

1.2.7免疫荧光检测 将亲本及耐药细胞用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗3次,0.5% Triton X-100室温透化5 min,封闭1 h,PBS洗3次,4 ℃ 过夜孵育荧光一抗FTO,PBS 洗3次、室温避光孵育荧光二抗2 h,DAPI 染核5 min、滴加抗淬灭液后拍照。

2 结果

2.1 利妥昔单抗耐药DLBCL细胞株鉴定将亲本及耐药细胞株分别重悬于RPMI-1640完全培养基及含10%新鲜人血浆RPMI-1640培养基中,观察细胞存活率。结果显示在0、2、10、50、100 μg/ml的利妥昔单抗作用下,LY8及LY8R细胞的IC50分别为0.54、47.15 μg/ml,耐药指数为87.31;LY18及LY18R细胞的IC50分别为47.90、227.0 μg/ml,耐药指数为4.74,差异均有统计学意义(t=68.12、7.425,均P<0.001)。见图1。

图1 CCK-8法测定细胞存活率

2.2 利妥昔单抗处理亲本与耐药细胞株的凋亡差异与对照组(0 μg/ml利妥昔单抗组)比较,50 μg/ml利妥昔单抗组和DLBCL耐药株(LY8R、LY18R)组细胞凋亡差异均无统计学意义,而亲本细胞株组(LY8、LY18),差异有统计学意义(P<0.001)。见图2。

2.3 RT-qPCR检测FTO在亲本与耐药 DLBCL 细胞株中的表达情况RT-qPCR检测结果显示,FTO在耐药细胞株中表达明显升高,表明FTO可能与DLBCL利妥昔单抗耐药存在相关性。见图3。

2.4 免疫荧光检测FTO蛋白在亲本与耐药 DLBCL 细胞株中的表达情况免疫荧光结果显示,FTO在耐药细胞株中表达明显升高,表明FTO可能

与DLBCL利妥昔单抗耐药存在相关性。见图4。

图4 免疫荧光检测FTO蛋白在亲本与耐药DLBCL细胞株中的表达情况 ×400

2.5 Western blot检测 FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在亲本与耐药 DLBCL 细胞株中的表达情况Western blot检测结果显示FTO、c-Myc在耐药细胞株LY8R、LY18R中表达升高,CEBPA表达降低,由此可见,FTO可能通过c-Myc、CEBPA影响DLBCL对利妥昔单抗的耐药。见图5。

图5 Western blot检测 FTO、c-Myc及CEBPA在亲本及耐药 DLBCL 细胞株的表达

2.6 RT-qPCR检测经抑制剂MA处理后FTO在耐药细胞株中的表达情况RT-qPCR检测结果显示,经抑制剂MA处理后,FTO在耐药细胞株中的表达明显降低。见图6。

图6 RT-qPCR检测经抑制MA处理后FTO在耐药细胞株中的表达情况

2.7 Western blot检测经抑制剂MA处理后,FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在耐药细胞株中的表达情况Western blot检测结果显示,经抑制剂MA处理后FTO、c-Myc在耐药细胞株中表达明显减少,而CEBPA在耐药细胞株中明显增多。见图7。

图7 Western blot检测经MA处理后,FTO、c-Myc、CEBPA蛋白在耐药细胞株中的表达情况

2.8 经抑制剂MA处理后耐药细胞对利妥昔单抗耐药性的影响CCK-8法结果显示,经MA处理后的LY8R和LY18R在0、2、10、50、100 μg/ml的利妥昔单抗刺激48 h后,细胞活力明显低于对照组,差异有统计学意义(t=16.37、11.96,均P<0.001),这表明抑制剂MA可能影响了DLBCL对利妥昔单抗的耐药性。见图8。

图8 CCK-8法测定细胞存活率

3 讨论

常规化疗和靶向治疗是大部分肿瘤的一线治疗方法,大多数早期肿瘤患者能取得完全或部分缓解,而晚期肿瘤患者往往治疗效果不佳,肿瘤细胞可通过多因素的耐药机制逃避化疗和靶向治疗[8]。肿瘤耐药的机制包括药物代谢改变、药物转运失调和靶蛋白/受体改变等,这些都影响药物与其靶标的有效结合,也是抗癌药物疗效不佳的主要原因[9]。利妥昔单抗作为治疗DLBCL的一线药物,在临床治疗上发挥重要作用,但耐药是患者最大的治疗障碍,尽管现如今对利妥昔单抗耐药机制尚不清楚,但越来越多的研究表明RNA m6A甲基化修饰促进了肿瘤的发生发展与耐药,如FTO通过作用于G6PD/PARP1,促进结直肠癌进展和化疗耐药,靶向抑制FTO能抑制癌细胞生长并提高化疗敏感性[10]。FTO通过信号转导因子和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)参与乳腺癌对阿霉素耐药过程,FTO启动子区域存在 STAT3 结合位点,能激活乳腺癌细胞STAT3信号,而STAT3的过度激活与乳腺癌耐药相关,因此过表达FTO会引起乳腺癌细胞对阿霉素的耐药[11]。

MYC是研究最广泛的致癌基因之一,其参与调节细胞生长、细胞周期、分化、凋亡、DNA 修复、蛋白质翻译、免疫反应和干细胞形成等过程[12-13]。MYC基因扩增与卵巢癌、食管癌、鳞状肺癌、乳腺癌等预后不良相关[14]。MYC染色体重排已被确定为 DLBCL 患者预后不良因素之一[15],这提示MYC的异常参与了DLBCL耐药过程。研究[6]发现, R-2HG可通过抑制FTO来促进MYC/CEBPA的甲基化水平并促进m6A依赖的mRNA降解,从而在AML中发挥抑癌作用。DLBCL利妥昔单抗耐药机制中是否与代谢通路相关,尤其是糖酵解通路等,有待进一步研究。

本研究采用梯度加药法构建利妥昔单抗耐药细胞系,并用流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot证明去甲基化酶FTO在耐药株中表达升高,c-Myc表达也增高,CEBPA表达降低,此外,耐药株经MA处理后,FTO表达下降且c-Myc表达也降低,CEBPA表达升高,这提示其可能通过FTO/c-Myc/CEBPA轴发挥利妥昔单抗抗性作用。CCK-8法结果显示,耐药株经MA处理后,细胞活力降低,表明MA可能影响DLBCL对利妥昔单抗的敏感性。目前对于利妥昔单抗耐药尚无相关药物进入临床使用,关于利妥昔单抗耐药机制仍需进一步深入研究。