MBL2作为男性肝癌患者预后标志物的分析与验证

王延峰,韩嘉奇,张 静

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要组织学亚型,原发性肝癌是2020年全球第六大最常见的癌症和第三大癌症死亡原因,男性的发病率和病死率比女性高2～3倍,且预后较差[1]。HCC的发生是一个涉及多种风险因素的复杂过程。慢性肝炎病毒感染、吸烟和过度饮酒是男性患者常见的危险因素[2]。早期筛查、诊断和治疗是改善HCC预后的关键。然而,性别相关的诊断、预后标志物的缺乏,高转移和复发率等因素直接降低了手术切除后HCC患者的生存率[3-4]。甘露糖结合凝集素2(mannose binding lectin 2,MBL2)位于人类10号染色体,在先天免疫系统中起着重要作用,而在恶性肿瘤中的关键作用是免疫监测,MBL2基因变异是癌症风险增加的因素之一[5]。目前,在儿童血液肿瘤中发现,MBL2基因的多态性与中性粒细胞减少症发生相关[6]。而MBL2在HCC中的作用尚不清楚。该研究利用生物信息学技术分析MBL2在不同性别HCC患者中的表达,细胞实验探究其对HCC细胞增殖的作用,为不同性别HCC患者个性化治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1HCC组织 收集2021年6月—2022年6月在延安大学附属医院治疗的46例HCC患者组织和癌旁组织(男性23例,女性23例),患者术前未经治疗。本研究获得了患者签署的知情同意书和延安大学医学院伦理委员会批准。

1.1.2HCC细胞系 本实验所使用的人HCC细胞系Huh7和MHCC-97H购买于上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html) 在线工具探究MBL2在不同HCC组织样本中的表达,选择TCGA dataset中的“Liver hepatocellular carcinoma”模块进行分析。HCC患者总体生存率在Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis)数据库中进行。在UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)数据库中下载HCC样本的RNA-seq数据,使用基因集富集分析(gene set enrichment Analysis,GSEA)软件(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)进行单基因富集信号通路分析。

1.2.2细胞培养与细胞转染 HCC细胞系Huh7和MHCC-97H用含有10%胎牛血清(澳大利亚PAA公司)的DMEM的培养基(澳大利亚PAA公司),置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。用于过表达MBL2基因的质粒购买于上海吉凯生物有限公司,根据jetPRIME试剂使用手册在HCC细胞中进行过表达质粒的转染。

1.2.3MTT实验 将Huh7和MHCC-97H细胞以3×103个/孔的密度接种到96孔板中。质粒分别转染24、48、72 h后,每孔加入0.01 ml MTT试剂,培养3～4 h。每孔加入0.15 ml二甲基亚砜后,使用酶标仪进行吸光度值的检测。

1.2.4细胞克隆形成实验 将Huh7和MHCC-97H细胞按照2×103个/孔的密度接种到6孔板中。质粒转染24 h后,在12孔细胞培养板中接种,接种密度为1×103个/孔,置于培养箱中培养2周。细胞集落用0.1%结晶紫进行染色,PBS清洗3遍后,在图像采集系统中拍照。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期与凋亡 细胞周期:将Huh7和MHCC-97H细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔板中,转染过表达质粒24 h后,用70%乙醇收集细胞,置于4 ℃冰箱过夜。用RNase A和PI使细胞再悬浮,避光收集悬浮液于检测管中。通过流式细胞术进行细胞周期测定。

细胞凋亡:将Huh7和MHCC-97H细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔板中,过表达质粒转染48 h后,收集细胞,并按照PI/FITC-AnnexinV凋亡检测试剂盒说明书对细胞进行处理。通过流式细胞术进行细胞凋亡测定。

1.2.6qRT-PCR实验 使用TRlzol试剂从细胞系和冷冻组织中提取总RNA。逆转录试剂盒用于cDNA的合成,根据SYBR green Premix Ex Taq II操作说明书进行qRT-PCR实验。人MBL2引物(上游5′-GTATGGCAGCGTCTTAC-3′,下游5′-TGTAGCCTCTGGCCCTTG-3′)和GAPDH引物(上游5′-GAGGTGAAGGTCGGAGT-3′;下游5′-CATGGGTGAATCATGGAA-3′)在上海生工生物有限公司合成。采用2-ΔΔCt法计算MBL2基因的表达量。

1.2.7Western blot实验 使用RIPA裂解液从细胞系和冷冻组织中提取蛋白质样品后,BCA试剂盒检进行蛋白浓度测定,加入20 μl 5×的蛋白缓上样冲液,煮沸10 min。应用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白质,转移到PVDF膜上。5%脱脂乳孵育1 h后,使用一抗(1 ∶1 000,武汉三鹰生物技术有限公司)孵育,置于4 ℃冰箱过夜。TBST洗膜3次后,使用HRP标记的羊抗兔二抗(1 ∶5 000,武汉三鹰生物技术有限公司)在室温下孵育2 h。再次洗膜3次后,置于化学发光仪中检测。β-actin作为内参。

2 结果

2.1 MBL2表达与患者性别的关系通过肿瘤数据库探究MBL2在HCC患者组织中的表达与性别的相关性。在TCGA数据库中分析表明,HCC组织中的MBL2表达低于正常组织(P<0.05,图1A),男性患者中MBL2的表达高于女性患者(P<0.05,图1B),MBL2在HCC中的表达存在明显的性别差异。

图1 TCGA数据库中分析HCC中MBL2的表达

2.2 MBL2表达对患者预后的影响利用生存分析探究MBL2表达对不同性别HCC患者预后的影响。Kaplan-Meier plotter数据库中分析显示:与MBL2低表达组比较,MBL2高表达组与男性HCC患者良好的预后显著相关(Log-rankP=0.017,图2A),而与女性HCC患者预后无关(Log-rankP=0.42,图2B),MBL2高表达对HCC患者预后影响存在着显著的性别差异。

图2 MBL2表达与HCC患者总生存率的相关性分析

2.3 MBL2在HCC组织中的表达通过在临床上收集不同性别HCC患者的组织,分析MBL2表达在HCC患者中的性别差异。qRT-PCR结果显示:与女性HCC患者比较,MBL2在男性HCC患者中的mRNA表达水平显著增高(P<0.05,图3A),与数据库中的结果一致。Western blot 结果表明MBL2在HCC组织中的蛋白表达水平显著下降(图3B)。

图3 HCC组织中MBL2的表达情况

2.4 MBL2在HCC细胞系中的过表达效率检测在HCC细胞系中转染MBL2过表达质粒,分为对照组和MBL2过表达组。实验结果显示:与对照组比较,Huh7(图4A)和MHCC-97(图4B)细胞中MBL2的mRNA和蛋白表达水平在MBL2过表达组中显著升高(tHuh7=12.050,tMHCC-97H=13.216,均P<0.01),MBL2过表达质粒可用于细胞功能实验。

图4 qRT-PCR、Western blot检测HCC细胞中转染MBL2过表达质粒后mRNA和蛋白表达水平

2.5 MBL2表达上调对HCC细胞系增殖的影响MTT实验结果显示:MBL2表达升高后,转染过表达质粒48 h以后Huh7和MHCC-97H细胞的活性显著下降(tHuh7-48 h=4.231,tMHCC-97H-48 h=5.780,tHuh7-72 h=6.124,tMHCC-97H-72 h=6.690,均P<0.05,图5)。细胞克隆形成实验表明,MBL2表达下调显著的抑制了Huh7和MHCC-97H细胞的克隆形成能力(tHuh7=12.311,tMHCC-97H=6.015;PHuh7<0.01,PMHCC-97H<0.05,图6)。

图5 MBL2 过表达质粒对HCC细胞系活性的影响

图6 MBL2 过表达质粒对HCC细胞系克隆形成能力的影响

2.6 MBL2表达上调对HCC细胞系周期和凋亡的影响流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的结果显示:上调MBL2表达后,显著的抑制了Huh7(图7A)和MHCC-97H细胞(图7B)的分裂(G1:tHuh7=7.030,tMHCC-97H=6.961;S:tHuh7=4.230,tMHCC-97H=3.652;G2:tHuh7=3.001,tMHCC-97H=4.132;均P<0.05),促进了Huh7(图8A)和MHCC-97H(图8B)细胞的早凋和晚凋[(早凋:tHuh7=2.990,tMHCC-97H=3.512;均P<0.05);(晚凋:tHuh7=7.625,tMHCC-97H=4.311;PHuh7<0.01,PMHCC-97H<0.05)]。

图7 MBL2 过表达质粒对HCC细胞系细胞周期的影响

图8 MBL2 过表达质粒对HCC细胞系凋亡的影响

2.7 MBL2表达调控的信号通路分析GSEA分析显示,MBL2表达上调显著的富集在细胞周期信号通路上(P<0.05)。Western blot结果显示,上调MBL2能够调控细胞周期信号通路的CDK4、P16、BAX蛋白的表达。见图9。

图9 上调MBL2表达对细胞周期信号通路的影响a:对照组;b:MBL2过表达组

3 讨论

研究[7]表明,HCC患者HBV感染的流行病学和临床特征方面存在显著的性别差异,这与男性HCC发病率和病死率的增高密切相关。然而,对人类HCC中性别依赖性基因表达的认识仍然稀少,研究HCC性别相关的基因可能具有重要的生物学和医学意义。MBL2位于人类10号染色体,在乙型肝炎病毒感染中发挥重要作用[8],MBL2突变与HCC风险之间的关系尚不清楚。为了改善男性HCC患者的预后,有必要探究MBL2表达对HCC患者预后的影响和作用机制。通过生物信息学分析发现MBL2在不同患者中的表达和预后存在着明显的性别差异,对男性HCC患者的预后有显著的影响,而与女性患者预后无相关性,这可能是由于公共数据库中女性HCC患者的数据量较小导致的,因此,MBL2对女性HCC患者生存的影响需要进一步探究。同时,临床HCC组织样本中检测MBL2的表达结果与公共数据库分析结果一致,提示其在男性HCC患者的发生和预后中有着重要的作用。本研究对HCC细胞Huh7和MHCC-97H转染MBL2过表达质粒,进一步分析了MBL2对HCC细胞系增殖的影响。MTT和细胞克隆实验表明,MBL2基因的表达上调能够显著的抑制Huh7和MHCC-97H细胞的增殖,同时细胞周期和凋亡实验提示MBL2基因表达的上调能够阻滞Huh7和MHCC-97H细胞的分裂,增加细胞的凋亡率。上述研究表明,MBL2在HCC中发挥着抑癌作用。

细胞周期是一个高度调节的过程,能够促进细胞生长、遗传物质的复制和细胞分裂,而细胞周期调节失控是肿瘤细胞过度增殖的重要原因[9]。CDK4、BAX和P16蛋白是细胞周期机制的关键组成部分,通过调控G1至S期转变在癌症中发挥关键作用,如控制增殖、衰老、迁移、凋亡和血管生成[10-11]。研究[12]显示,微染色体维护家族基因被认为是细胞周期S/G2进展的驱动因素,可做为HCC的潜在诊断和预后标志物。另有研究[13]表明,ASF1B通过影响HCC细胞周期和增殖,可能成为HCC患者治疗的新靶点。本研究通过GSEA分析发现,MBL2表达显著的富集在细胞周期信号通路上,且过表达MBL2能够影响细胞周期信号通路中的CDK4、BAX和P16蛋白的表达。综上结果推测MBL2可能是通过调控细胞周期信号通路影响了HCC细胞系的增殖和凋亡,这将为HCC分子机制的研究提供新的方向。

综上所述,MBL2在HCC患者中的低表达,且与男性HCC患者的预后密切相关。过表达MBL2能够抑制HCC细胞的增殖,增加细胞凋亡率。MBL2可能是男性HCC患者治疗的一个新靶点,MBL2表达在HCC的性别差异机制仍需要进一步探究。