鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建及其部分功能研究

姚 燕,王淑贤,吴银翠,胡 爽,胡 颖,潘林鑫,徐 涛

核孔蛋白85(Nucleoporin 85,NUP85)是核孔复合体(Nuclear pore complex,NPC)中NUP107～160亚复合体(同义Y复合体)的9个成员之一[1]。NPC是指镶嵌在核孔上的一种复杂结构,主要调节大分子跨核膜的运输。单个核孔蛋白具有基因表达调控、DNA修复、调控细胞凋亡等作用[2]。研究[3]表明,NUP85可与巨噬细胞上表达的C-C-趋化因子受体(C-C-chemokine receptor 2,CCR)2和CCR5相互作用,促进趋化信号传导。此外,NUP85还可以通过调节肿瘤相关巨噬细胞调节肿瘤进展,并对炎症具有一定作用[4],但具体调控作用及机制尚不清楚。而炎症是肿瘤进展的关键因素,对调节免疫细胞进出肿瘤微环境具有重要作用。肿瘤细胞产生各种细胞因子和趋化因子,吸引白细胞,包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等[4]。为进一步研究NUP85的功能,该研究通过构建NUP85的真核质粒,首次探讨NUP85在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞中对炎症因子(TNF-α、IL-6)的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料RAW264.7细胞株(安徽医科大学药学院保存);DMEM培养基(美国Thermo Scientific公司);NUP85抗体(美国Santacruz公司);IL-6抗体(沈阳万类生物科技有限公司);TNF-α抗体(南京巴傲得生物科技有限公司);ECL化学发光试剂盒(苏州新赛美生物科技有限公司);Lipofectamine 2000和Trizol(美国Invitrogen公司);胎牛血清(美国Gibco公司);PVDF膜(北京索莱宝科技有限公司);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物有限公司);质粒抽提试剂盒、BamH I、XhoI内切酶(美国Axygen公司);脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司);细胞培养瓶、细胞培养板(无锡耐思生命科技股份有限公司);山羊抗鼠IgG/辣根酶标记、山羊抗兔IgG/辣根酶标记(北京中杉金桥生物技术有限公司);ELISA(IL-6、TNF-α)试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒的构建 通过PCR扩增NUP85基因,构建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒。酶切鉴定无误后,由上海吉玛制药技术有限公司进行测序鉴定。

1.2.2pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒的转染与实验分组 将细胞按1×106个/孔的密度均匀种入6孔板内继续培养。将A液(250 μl的Opti-MEM及2 μg pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒)与B液(250 μl的Opti-MEM及5 μl Lipofectamine 2000脂质体)分别置于1.5 ml无酶EP管中静置5 min后,将A液和B液混匀,静置20 min后,将其置于6孔板中再补齐Opti-MEM培养基至2 ml。6 h后换液,培养24 h后以进行后续实验。

实验分为正常组:未进行任何处理;LPS组:加100 ng/ml LPS刺激;对照组(LPS+pcDNA3.1-3×Flag-c组):转染空载体质粒并加100 ng/ml LPS刺激;NUP85过表达组(LPS+pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85组):转染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒并加100 ng/ml LPS刺激。

1.2.3Western blot实验 弃去6孔板中的培养基,PBS洗3遍,在蛋白裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)中裂解细胞,提出总蛋白。用BCA蛋白质检测试剂盒检测蛋白质浓度。取等量的蛋白加入上样孔,进行SDS-PAG凝胶电泳。在恒流200 mA条件下湿转60 min,使蛋白转至PVDF膜上,在脱脂奶粉(50 g/L)中封闭2 h后,用TBST缓冲液清洗,并在相应的一级抗体中孵育12 h,一抗稀释度分别为NUP85(1 ∶500),TNF-α(1 ∶1 000),IL-6(1 ∶1 000)。TBST洗3遍后,室温孵育二抗1 h,TBST清洗后用ECL化学发光试剂盒进行显影并拍照。

1.2.4CCK-8实验 将RAW264.7细胞按5 000个/孔的密度接种到96孔板中,每组设6个复孔,再向每孔转染约70 ng pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒,6 h后更换为含100 ng/ml LPS的培养基,再培养24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液,正常培养2 h,在避光条件下检测每孔在450 nm处的吸光度,计算细胞存活率。

1.2.5流式细胞术 将RAW264.7细胞按1×106个/孔的密度均匀种入6孔板内,转染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒,6 h后更换为含有100 ng/ml LPS的培养基,继续培养24 h。然后用PBS清洗3遍,收集所有细胞于15 ml离心管中,用400 μl Annexin V结合液重悬细胞,再加入5 μl FITC避光孵育10～15 min,再加入10 μl PI,避光孵育5 min后,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并记录。

1.2.6ELISA检测炎症因子的分泌 将RAW264.7细胞按1×106个/孔的密度均匀种入6孔板内,转染对照组空载体质粒和pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒,6 h后更换为含有100 ng/ml LPS的培养基,继续培养24 h。24 h后收集细胞上清液,使用ELISA方法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6的分泌情况,步骤完全按照ELISA(TNF-α、IL-6)检测试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建通过PCR方法扩增目的基因,利用Bam H I、Xho I双酶切扩增产物和pcDNA3.1-3×Flag-c载体,并用T4 DNA连接酶连接两产物,将连接产物转化细菌感受态细胞,用抽提试剂盒提取质粒。酶切鉴定结果显示:pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒成功构建,即阳性克隆显示在目的条带大小对应的区域有酶切得到的条带对应的克隆,如图1所示。将阳性克隆送至上海吉玛制药技术有限公司进行测序鉴定。

图1 重组质粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85的酶切鉴定

2.2 pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的表达用Western blot技术检测将pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒转染至RAW264.7细胞后的NUP85蛋白表达情况。结果显示:LPS组的NUP85的蛋白表达量高于正常组(t=7.650,P<0.01);过表达组的NUP85的蛋白表达量高于转染空载体的对照组(t=10.28,P<0.01),表明pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒成功表达,见图2。

图2 重组质粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85的蛋白表达

2.3 NUP85对RAW264.7细胞增殖的影响将pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒转染至RAW264.7细胞中,用CCK-8法检测细胞的增殖情况。结果显示:24 h后LPS组和转染空载体对照组的细胞存活率分别为(0.74±0.08)和(0.67±0.05),过表达NUP85组的细胞存活率为(0.55±0.03),低于LPS组和转染空载体对照组的细胞存活率(F=30.98,P<0.05),表明在LPS刺激的RAW264.7细胞中,过表达NUP85能够抑制细胞的增殖,见图3。

图3 CCK-8检测细胞增殖

2.4 NUP85对RAW264.7细胞凋亡的影响用细胞凋亡检测试剂盒和流式仪检测将pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85过表达质粒转染至RAW264.7细胞24 h后的细胞凋亡率。结果显示:24 h后正常组的细胞凋亡率为(6.74±0.46)%,LPS组及转染空载体对照组的细胞凋亡率分别为(13.13±0.21)%和(13.40±0.47)%,而NUP85过表达组的细胞凋亡率为(15.78±1.05)%,高于对照组(F=75.38,P<0.05),表明在LPS刺激的RAW264.7细胞中,过表达NUP85能够促进细胞的凋亡,见图4。

图4 重组质粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85对RAW264.7细胞凋亡的影响

2.5 NUP85在RAW264.7细胞中对炎症因子表达的影响用Western blot技术检测将pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒转染至RAW264.7细胞后的IL-6和TNF-α蛋白表达情况。结果显示:过表达组中的TNF-α表达较转染空载体对照组升高(F=174.4,P<0.01);IL-6的表达较转染空载体对照组升高(F=105.3,P<0.01),表明在RAW264.7细胞中,过表达NUP85促进炎症因子TNF-α和IL-6的表达,见图5。

图5 重组质粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85转染后Western blot检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达

2.6 NUP85在RAW264.7细胞中对炎症因子分泌的影响使用ELISA方法检测将pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒转染至RAW264.7细胞后的IL-6和TNF-α蛋白分泌情况。结果显示:过表达NUP85组中的TNF-α表达较转染空载体对照组升高(F=479.8,P<0.001);IL-6的表达较转染空载体对照组升高(F=216.5,P<0.001),表明在RAW264.7细胞中,过表达NUP85促进炎症因子TNF-α和IL-6的分泌,见图6。

图6 重组质粒pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85转染后ELISA检测炎症因子IL-6和TNF-α的分泌

3 讨论

NUP85作为NUP107～160复合体的一部分,构成了NPC的外环,参与NPC的组装和维护[5]。NUP85是一种细胞质蛋白,在巨噬细胞中高度表达,参与炎症,并通过调节肿瘤相关巨噬细胞影响肿瘤进展[3]。而炎症是肿瘤的基础过程,缓解炎症反应对肿瘤的治疗十分重要。巨噬细胞通过清除细胞碎片、缓解炎症,在炎症和肿瘤中发挥关键作用[6]。作为人体内最重要的吞噬细胞之一,RAW264.7细胞负责摄取和消化许多微生物和组织中衰老、死亡和受损的细胞,还可以释放一系列炎症介质,例如TNF-α、IL-6等[7]。这些炎症因子表达水平的变化在炎症反应中起着重要作用,抑制这些炎症因子的分泌有助于炎症的治疗。在体外实验中,常选用LPS诱导RAW264.7细胞作为炎症细胞模型[6]。因此,本研究在用LPS诱导RAW264.7细胞后,探讨NUP85对炎症因子TNF-α和IL-6表达的影响。此外,细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式,细胞内信号或外源信号均可触发凋亡,细胞凋亡的改变与肿瘤的发生和发展有关[8]。而NUP85是否对RAW264.7细胞凋亡产生作用,国内外尚未有文献报道。因此,本实验也研究了NUP85对RAW264.7细胞凋亡的影响。 虽然NUP85在人类细胞中的确切分子功能仍不清楚,但已知其能与趋化因子受体CCR2和CCR5结合调节趋化信号传导,在一些动物模型中,CCR2和CCR5的阻断已被证明可以抑制肿瘤的进展,这使得NUP85成为一个有吸引力的治疗靶点[9]。因此,本研究通过构建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85过表达质粒,初步了解NUP85的功能。酶切鉴定显示质粒成功构建,并将质粒转染至RAW264.7细胞,Western blot结果进一步证明质粒成功表达。CCK-8结果显示NUP85过表达后能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的增殖。另流式细胞术检测NUP85对RAW264.7细胞凋亡的调节作用,结果显示,NUP85过表达后能够促进RAW264.7细胞的凋亡。此外,通过向RAW264.7细胞转染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒建立NUP85过表达模型,研究NUP85对炎症因子IL-6和TNF-α分泌的调节作用。Western blot结果显示,过表达NUP85后,IL-6和TNF-α的表达水平上调,ELISA结果进一步表明过表达NUP85能够促进炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。这些实验结果表明NUP85能够抑制RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡,并能促进炎症因子TNF-α和IL-6的分泌。这为今后炎症相关疾病的治疗打下了坚实的基础。另有研究[10]表明,mTOR信号通路在炎症性疾病中对炎症具有调节作用,并能抑制部分白细胞介素炎症因子的产生[11]。基于以上文献和相关实验结果,猜测NUP85可能通过mTOR信号通路影响炎症因子的分泌。然而,NUP85与凋亡和炎症之间的具体作用机制有待进一步研究。接下来课题组将对NUP85在动物模型和临床样本中的潜在应用进行深入研究。