超高效液相色谱法检测58 种大豆中的4 种嘌呤化合物

孙玉凤，黄亚涛，刘佳萌，贯东艳，范 蓓，王凤忠

（中国农业科学院农产品加工研究所 农业农村部农产品质量安全收贮运管控重点实验室 北京 100193）

大豆是豆科、蝶形花亚科、大豆属植物，古代称“菽”，在我国已有5 000 多年的栽培历史。大豆在我国各地均有栽培，品种丰富，至今为止资源库中已保有30 000 多个大豆种质[1]。大豆富含多种营养物质及功能因子，是我国重要的粮食、油料及饲料来源。大豆中同时存在天然毒素嘌呤化合物，它是一种含氮杂环类有机化合物，由鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤组成。嘌呤化合物代谢的最终产物为尿酸，由肠黏膜吸收进入体液后随尿液排出，人体中尿酸过高可诱发痛风[2]。医学界普遍认为痛风病人不宜摄入大豆食品。一项对亚太地区的医学工作者的调查显示，48%的医学工作者认为摄入大豆会导致痛风[3]。明确大豆中嘌呤化合物的含量，可为大豆加工及消费提供科学指导。

目前研究人员采用多种前处理方法和检测手段对嘌呤化合物进行定量研究，嘌呤检测中样品前处理方法主要有酸解提取法、溶剂提取法、柱萃取、膜萃取、离子交换柱纯化法和超声提取法等[4]。常用的检测方法为反相离子对色谱法[5]、高效液相色谱法[6-9]、液相色谱串联质谱法[10]等。在对大豆嘌呤化合物的检测中，大多数只针对某一品种，尚未对多种大豆资源的嘌呤化合物进行比较研究。本研究探讨大豆中嘌呤化合物的色谱分离条件及提取条件，建立大豆中嘌呤化合物含量检测的超高效液相色谱法，以完善我国不同大豆主栽品种的嘌呤化合物数据，为大豆加工的品种选用及合理膳食提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆样品：58 种大豆样品均由大豆产业技术体系试验站提供，样品经过粉碎机粉碎后，4 ℃保存备用。

标准品：腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤（色谱纯，纯度≥99.0%），上海安普实验科技股份有限公司；甲醇、甲酸、磷酸二氢钾、磷酸、高氯酸、三氟乙酸（均为色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；甲酸铵（色谱纯），Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器及设备

超高效液相色谱仪（Acquity UPLC）、色谱柱（Acquity UPLCHSS T3）（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美国沃特世公司；电子分天平（MS105DU）、pH 计（Mettler Toledo），瑞士梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超纯水系统（Milli-QAdvantageA10），香港力康生物医疗技术控股集团；超声波清洗器（KQ-600DE），昆山超声仪器有限公司；恒温水浴锅（DK-8D 型），上海一恒科技有限公司；SHB-III 型循环水式真空抽滤装置，巩义市予华仪器有限责任公司；氮吹仪（TTL-DC II 型），北京同泰联科技发展有限公司；0.22 μm 微孔滤膜，天津市科亿隆实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件的优化

1.3.1.1 流动相的选择 色谱柱为Acquity UPLCHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相分别为0.02 mol/L 的磷酸二氢钾（pH=3.40）和0.01 mol/L 的甲酸铵（pH=3.40），进样量1 μL，柱温为30 ℃，流速为0.1 mL/min，检测波长为254 nm，探究磷酸二氢钾流动相和甲酸铵流动相对4 种嘌呤化合物的分离效果。

1.3.1.2 pH 值的选择 确定流动相为0.01 mol/L甲酸铵后，分别设置pH=3.30，3.40，3.50，3.60 4个组，进样量1 μL，柱温为30 ℃，流速为0.1 mL/min，检测波长为254 nm，探究不同pH 值对4 种嘌呤化合物的分离效果。

1.3.2 嘌呤化合物提取条件的优化

1.3.2.1 提取溶剂的选择 选取以下两种提取溶液，探究不同提取溶剂对4 种嘌呤化合物的提取效果。

A：三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合溶液。

按以下步骤操作：准确称取冀豆16 号、冀黑豆1 号大豆粉末0.100 g，分别置于10 mL 玻璃试管中，向其中加入1 mL 水混匀，再加入1 mL 酸液，混匀后置于沸水浴水解30 min，立即冷却，氮吹至体积约为0.5 mL，加水4 mL 后，用15 mol/L KOH 溶液调节pH 值至3.4，以5 000 r/min 转速离心20 min，取上清定容至5 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，备用。

B：6%高氯酸溶液。

按以下步骤操作：准确称取冀豆16、冀黑豆1号大豆粉末0.100 g，分别置于10 mL 玻璃试管中，向其中加入2 mL 6%高氯酸，混匀，沸水浴水解30 min，立即冷却，用15 mol/L 氢氧化钾溶液调节pH 值至3.4，以5 000 r/min 转速离心20 min，取上清定容至5 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，备用。

1.3.2.2 水解时间的选择 以冀豆16 号和冀黑豆1 号为对象，操作步骤同1.3.2.1 节A，沸水浴中水解时间分别调整为15，30，60 min，探究不同水解时间对4 种嘌呤化合物的提取效果。

1.3.3 标准曲线的制备 配制250 mg/L 鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤单一标准储备液，吸取各嘌呤单一标准储备液1 mL 于5 mL 容量瓶中，用纯水定容至刻度，配制成50 mg/L 的混合中间液。准确移取0.04，0.08，0.2，0.4，0.8，2 mL 混合中间液至6 个10 mL 棕色容量瓶，用超纯水定容至刻度，配制为0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，10 mg/L 的系列梯度溶液，过0.22 μm 微孔滤膜，用已确定的最佳色谱方法进行超高效液相色谱分析。以峰面积（Y）及样品质量浓度（X）作标准曲线，以3 倍信噪比（S/N）所对应的浓度为检出限（LOD）。

1.3.4 方法性能研究

1.3.4.1 精密性检验 按照1.3.3 节所述方法，选取一个浓度标准样品（4.0 mg/L）用已确定的最佳色谱方法连续进样5 次，分别对鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤的峰面积进行测定，然后计算其相对标准偏差值（RSD）。

1.3.4.2 重复性检验 选取冀豆16 大豆粉末样品6 份，分别称取0.100 g，按照确定的最佳嘌呤提取方法处理，将6 份处理的样品进行超高效液相色谱分析，色谱条件同1.3.1 节所述，根据测定量计算其相对标准偏差（RSD）。

1.3.4.3 加标回收率检验 分别称取冀豆16 大豆粉末样品12 份，每份0.100 g，按照确定的最佳嘌呤提取方法处理，将12 份处理的样品进行超高效液相色谱分析，色谱条件同1.3.1 节所述。之后，按每种嘌呤含量的0.5，1，2 倍加入嘌呤标品，配制成低、中、高3 个浓度，上机检测。每个样品测定3 次，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

1.3.4.4 58 种大豆中4 种嘌呤化合物含量的测定准确称58 种大豆粉末0.100 g，按照确定的最佳嘌呤提取方法处理，将处理的样品进行超高效液相色谱分析，色谱条件同1.3.1 节所述，每个样品测定3 次，分析58 种大豆样品中嘌呤化合物的含量。

2 结果与分析

2.1 优化的色谱条件

采用0.02 mol/L 磷酸二氢钾（pH=3.40）和0.01 mol/L 甲酸铵（pH=3.40）分别作为流动相，探究流动相种类对4 种嘌呤化合物的分离效果。当以0.02 mol/L 磷酸二氢钾（pH=3.40）为流动相时，结果如图1a 所示，无法分离4 种嘌呤化合物，鸟嘌呤与腺嘌呤出峰时间重叠。当以0.01 mol/L 甲酸铵（pH=3.40）为流动相时，结果如图1b 所示，4种嘌呤化合物都能得到较好的分离，峰形也比较好，没有拖尾现象，因此，判定此流动相适合多组分嘌呤化合物的分离。

图1 流动相的种类对4 种嘌呤分离效果的影响Fig.1 Influence of mobile phase types on purine separation effect of four kinds

采用pH 值分别为3.30，3.40，3.50，3.60 的0.01 mol/L 甲酸铵为流动相，探究不同pH 值对4种嘌呤化合物的分离效果，结果如图2 所示。试验表明，流动相的pH 值对4 种嘌呤化合物的分离度和峰形均存在较大影响，流动相的pH 值过高或过低均不利于4 种嘌呤化合物的分离。当pH值为3.30 时，鸟嘌呤和腺嘌呤分离度小于0（图2a）。当pH 值为3.40 时，鸟嘌呤和腺嘌呤分离度达到1.78（图2b），分离度较好，4 种嘌呤分离度均符合要求。当pH 值继续升高达到3.50 时，黄嘌呤出现异峰（图2c）。继续调节pH 值至3.60 时，只分离出3 个峰，腺嘌呤和次黄嘌呤未被分开，合并成一个峰，且黄嘌呤峰形呈现前沿峰（图2d）。综上所述，本研究选用pH 值为3.40 的0.01 mol/L 甲酸铵溶液作为最佳流动相。

图2 流动相pH 值对4 种嘌呤分离效果的影响Fig.2 Influence of pH value of mobile phase on the separation effect of four purines

2.2 优化的嘌呤化合物提取条件

2.2.1 选择的提取溶剂 嘌呤化合物在食物中主要以结合态形式存在，在测定嘌呤化合物含量时要将其水解成4 种游离嘌呤碱基再测定[11]。提取嘌呤的方法主要有酸解提取法、柱萃取、膜萃取法等，其中最常用的是酸解提取法，而酸解提取法中最常用的酸主要是高氯酸[12]和三氟乙酸甲酸混合溶液[13]两种。不同酸解提取法对嘌呤含量测定的影响如何，至今少有报道。本研究选用三氟乙酸∶甲酸（V ∶V=1 ∶1）混合溶液及6%高氯酸溶液作为提取溶剂，分别对冀豆16 号和冀黑豆1 号进行嘌呤化合物提取，并通过超高效液相色谱进行测定，结果如表1 所示。

表1 不同提取溶剂测定结果（n=3）Table 1 Determination results of different extraction solvents（n=3）

由表1 可知，用三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合溶液作为提取溶剂时，冀豆16 号和冀黑豆1 号中4 种嘌呤化合物含量测定值显著高于6%高氯酸溶液提取组，其中，次黄嘌呤使用前者条件提取后的测定值是后者的4 倍以上，鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤使用前者条件提取后的测定值是后者的1.21～1.35 倍，总嘌呤使用前者条件提取后的测定值是后者的1.22～1.27 倍。虽然高氯酸水解法操作简单、成本低，但是高浓度的高氯酸会降解嘌呤化合物，造成测定结果偏低[14]。三氟乙酸和甲酸易挥发，经过氮吹后可除去大部分酸，降低样液中盐浓度，水解效果好，嘌呤损失小[12]。因此，本研究选择三氟乙酸∶甲酸（V ∶V=1 ∶1）混合溶液作为最佳提取溶剂。

2.2.2 选择的水解时间 在样品前处理方法中，前人对嘌呤化合物的水解温度做了大量研究，结果表明嘌呤化合物的最佳水解温度为100 ℃[15-17]，在水解时间上，刘镇等[15]选用30 min 水解酿造黄酒用粮食原料中的嘌呤，毛玉涛等[18]选用60 min水解豆浆中嘌呤。为确定嘌呤化合物最佳水解时间，本研究以冀豆16 号和冀黑豆1 号为对象，分别设置了15，30 和60 min 进行水解处理，其它操作步骤按照1.3.1 节所述进行，并通过超高效液相色谱进行测定，结果如表2 所示。

表2 不同水解时间测定结果（n=3）Table 2 Determination results of different water bath times（n=3）

由表2 可知，水解时间为30 min 时，冀豆16号和冀黑豆1 号中4 种嘌呤化合物含量测定值显著高于15 min 组和60 min 组，表明水解时间在15～60 min 之内，随着时间的延长，样品中鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的含量均随水解时间的延长呈现低-高-低的趋势，说明水解时间过短或过长都会对大豆中嘌化合物含量测定值产生影响。水解时间过短会导致嘌呤化合物从结合态向游离态转化不彻底或未转化，水解时间过长会引起游离态的嘌呤化合物发生降解，导致测定结果偏低。因此，本研究选择30 min 作为嘌呤化合物最佳水解时间。

2.3 标准曲线

按照确定的最佳超高效液相色谱条件，将配置好的嘌呤混合标准梯度溶液检测，以峰面积（Y）及样品质量浓度（X）作标准曲线，线性关系及检出限结果见表3。4 种嘌呤化合物在0.2～10 mg/L 质量浓度范围线性关系良好，相关系数（R2）均在0.9995 以上。检出限在0.0412～0.1001 mg/L 之间，灵敏度较高，可以满足试验的要求。

表3 嘌呤化合物标准曲线结果Table 3 Result of purine standard curve

2.4 方法性能研究

2.4.1 方法精密性 相对标准偏差结果见表4，相对标准偏差均小于0.6000%，表明本研究建立的超高效液相色谱检测方法精密度良好，重现性高，可应用于样品检测。

表4 精密性结果Table 4 Result of precision

2.4.2 方法重复性 按照确定的最佳提取条件及色谱条件对冀豆16 大豆粉末样品中的嘌呤化合物进行提取和测定，结果显示：鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤含量的相对标准偏差分别为1.1103%，1.0728%，1.3762%，0.9457%，表明重复性较好。

2.4.3 加标回收率 加标回收试验结果见表5，鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤平均回收率分别为96.6225%，100.1373%，93.4343%，92.5926%，说明采用本研究确定的最佳提取条件可有效保留嘌呤化合物，减少样品中嘌呤化合物的损失。

表5 加标回收试验结果（n=3）Table 5 Recovery rates of samples with added specimen（n=3）

2.5 大豆样品检测结果与分析

按照确定的最佳提取条件及色谱条件，对我国不同主栽品种共计58 种大豆中嘌呤化合物进行提取和测定，每种样品平行测定3 次，结果见表6。

表6 大豆样品中4 种嘌呤化合物的含量（mg/kg）Table 6 The contents of four kinds of purine in soybean samples（mg/kg）

由表6 可知，所有大豆样品嘌呤含量中，鸟嘌呤含量最高，其次为腺嘌呤，黄嘌呤及次黄嘌呤在有的大豆品种未检出，这与刘少林等[19]的研究结果一致。不同品种大豆中嘌呤含量差异较大，嘌呤含量在1 745.88～2 824.54 mg/kg 之间，高蛋白大豆品种中嘌呤含量高于2 300 mg/kg，其中冀豆23 嘌呤含量高达2 548.34 mg/kg；常规大豆品种中嘌呤含量在2 000～2 300 mg/kg 之间；高油、蛋脂双高大豆品种中嘌呤含量低于2 000 mg/kg，其中中黄76嘌呤含量最低，为1 745.88 mg/kg；无腥大豆品种中嘌呤含量差异较大，绥无腥豆、五星1 号、五星2 号、五星3 号嘌呤含量分别为2 013.06，2 162.31，2 274.36，2 824.54 mg/kg。

Kaneko 等[8]测定了包括豆类及豆制品在内的270 种食品中嘌呤含量，根据嘌呤含量将食品划分为5 组，即极低组（＜500 mg/kg）、低组（500～1 000 mg/kg）、中组（1 000～2 000 mg/kg）、高组（2 000～3 000 mg/kg）、超高组（＞3 000 mg/kg），由此判断，大豆介于嘌呤含量中组和高组。在明确大豆品种嘌呤含量的基础上，选择适当类型的大豆品种，结合加工工艺[20-23]，可以更好地生产出适宜不同人群的大豆制品。

3 结论

超高效液相色谱法具有灵敏度高、分析速度快等优点，本文建立了检测大豆中4 种嘌呤化合物的超高效液相色谱法，选用Acquity UPLCHSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）为色谱柱，以00.01 mol/L pH 值为3.40 的甲酸铵溶液为流动相，流速为0.1 mL/min，柱温30 ℃，进样量1 μL，检测波长为254 nm，检测大豆中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤。经方法学验证，此方法在线性范围（0.2～10 mg/L）线性关系良好（R2＞0.9995），方法检出限为0.0412～0.1001 mg/L，方法精密度RSD 小于0.6000%，重复性试验结果表明腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤RSD 值依次为1.1103%，1.0728%，1.376%，0.9457%。4 种嘌呤化合物加标回收率在92.5926%～-100.1373%之间，适用于大豆中4 种嘌呤化合物的测定。本文还研究比较确定了理想的提取溶剂为三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合溶液，理想的水解时间为30 min。应用此方法测定的我国部分大豆主栽品种中嘌呤化合物含量数据显示，不同大豆品种中嘌呤含量：高蛋白品种＞常规品种＞高油、蛋脂双高品种，无腥大豆品种中嘌呤含量差异较大，该研究结论可为大豆加工及消费提供科学指导。