基于网络药理学和分子对接探讨马齿苋抗变应性接触性皮炎作用机制

陈 霞,樊官伟,陈云志,王 艳,孔祥艳,蒲 翔*

1.贵州中医药大学(贵州 贵阳 550025) 2.天津中医药大学(天津 300193) 3.贵州中医药大学第一附属医院(贵州 贵阳 550001)

变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis,ACD),又称过敏性接触性皮炎,是一种由皮肤接触过敏原而导致的炎症性皮肤病,具有高发病率、高复发性、以及致病因素难确定的特点[1]。全球约15%～20%的人群受ACD的影响,女性患病率约为男性的2倍[2]。ACD的发病按临床病损程度分为3型:Ⅰ型患者常表现红斑,伴有丘疹,瘙痒、灼热等表现;Ⅱ型出现水肿样的红斑和水疱;Ⅲ型可见糜烂,也可见渗液[3]。目前ACD的药物治疗主要以糖皮质激素药物局部使用为主,当出现较严重且累及范围较广的病变时,常使用全身性的类固醇、免疫抑制剂进行治疗,如环孢素、咪唑硫嘌呤等,但以上药物长期使用会导致停药后出现如糖尿病、骨坏死、体质量上升、皮肤萎缩等副作用[4]。中药通过调节机体免疫、抑制炎症反应、氧化应激等多种途径发挥抗ACD作用,并以其独特的临床疗效和较低的毒副作用帮助患者减轻了身心负担[5-6]。目前已有较多中药单体、单味药及复方应用于ACD临床治疗。马齿苋首载于《蜀本草》,味酸、性寒,为药食两用的常用药材,有清热解毒、消肿消炎之功效,马齿苋化学成分主要有黄酮类、萜类、多糖、有机酸、生物碱、香豆素、醇及脂以及部分无机盐和微量元素[5],在抗炎、调节免疫、抗氧化、神经保护、抗菌等方面应用广泛[6],多用于热毒血痢、皮炎、丹毒、蛇虫咬伤等症[7]。故马齿苋常用于治疗包括湿疹、特应性皮炎以及ACD等炎症性皮肤病[8]。但马齿苋治疗ACD的潜在分子机制研究甚少,相关药理实验较为欠缺,使其在临床应用及相关疾病药物开发中受限。因此,本文旨在深入挖掘马齿苋抗ACD的主要活性成分和关键靶点蛋白,通过网络药理和分子对接技术对其相关作用机理进行预测,从而为临床应用和药物研制提供更多的理论基础。

1 资料与方法

1.1马齿苋活性成分及其靶点获取利用中药系统药理学数据库(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),以“马齿苋”为检索关键词,设定口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18为筛选条件,筛选出马齿苋的主要活性成分和靶点。统一使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库,将输出的所有靶点信息转化为标准的基因名称。

1.2疾病靶点的筛选利用GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库,以“allergic contact dermatitis”为关键词,检索出与ACD相关的基因靶点,将药物和疾病的靶点信息分别导入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线平台,绘制Venny图,得到马齿苋和ACD的共同靶点。

1.3关键靶点PPI网络构建将筛选出的马齿苋-ACD共有靶点导入String(https://string-db.org/)中,设置生物种类为“Homo sapiens(人类)”,构建靶点互作网络图(PPI),置信度为0.9,隐藏网络中的离散点,将结果保存为TSV文件,导入Cytoscape 3.9.0,选择其“Network Analyzer”进行分析,确定马齿苋抗ACD的核心靶点。

1.4GO富集分析和KEGG分析在Metascape数据库(https://metascape.org)中导入马齿苋与ACD的交叉靶点,选择GO富集分析和KEGG信号通路富集分析,其中GO富集分析包括3个板块:生物过程、分子功能和细胞成分。富集分析结果均以彩色条形图呈现。

1.5药物成分与分子靶点对接在RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载核心靶点排名前3的RELA的晶体结构(ID:4kv4)、JUN的晶体结构(ID:1jnm)、TNF(ID:2az5),化合物通过TCMSP、PubChem进行下载,并使用Chem 3D最小化能量,启动运行SYBYL-X 2.0软件模块中的“Dock Ligand”模块对接RELA、JUN和TNF的晶体结构,进行加氢、修复侧链、并选择自动寻找活性位点等处理。

2 结果

2.1活性成分的筛选通过检索TCMSP数据库,以OB值≥30%且DL≥0.18为筛选条件,最终得出10个活性成分,分别为:花生四烯酸、环阿屯醇、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、山奈酚等,潜在靶点318个,见表1。

表1 马齿苋活性成分及靶点数

2.2疾病和药物相关靶点的筛选在GeneCards数据库中以“allergic contact dermatitis”为关键词,检索出与ACD相关靶基因共1290个,采用Venny 2.1对二者相关靶点进行绘制(图1),得到共有靶点110个,这些靶点包括核因子P65(RELA)、氨基末端激酶基(JUN)、肿瘤坏死因子(TNF)、转录激活因子1(STAT1),白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、蛋白激酶B(AKT1)、肿瘤蛋白P53(TP53)、细胞外蛋白调节激酶1(MAPK1)、原癌基因Fos(FOS)等。

图1 马齿苋活性成分靶点与ACD交集靶点

2.3马齿苋抗ACD直接作用靶点拓扑参数分析利用String(https://string-db.org/)数据库构建关键靶标之间的相互作用图,将马齿苋治疗ACD的共有靶点导入String中,得到PPI网络图(图2),其中节点数=110、边数=367、平均节点度=6.67、平均局部聚类系数=0.403、期望边数=101。结果以TSV格式导出,通过Cytoscape 3.9.0获取PPI网络中的拓扑参数,采用Cytoscape 3.9.0插件“Network Analyzer”共有靶点的度,中间,中心性和紧密度,发现RELA(Degree=30)、JUN(Degree=29)、TNF(Degree=26)等综合排名靠前(图3),说明这些靶点在马齿苋治疗ACD中发挥极大作用。

图2 蛋白互作网络图

图3 前10位的靶点蛋白互作图

2.4GO富集分析和KEGG分析为进一步探讨马齿苋治疗ACD的多层作用机制,在Metascape数据库中导入110个共有靶点进行GO和KEGG富集分析,经分析得到生物过程(BP)1497个条目,细胞组分(CC)66个以及分子功能(MF)136个条目,按P值筛选,将前20个条目于图4进行表达。其中,BP主要涉及对脂多糖的反应,对细菌起源分子反应,细胞对脂质的反应等;CC主要涉及膜筏、膜微区、膜侧、囊腔以及转录调节复合体等;MF主要包括细胞因子受体结合、细胞因子活性、蛋白质同质二聚体活性以及DNA结合转录因子等。

A:生物过程;B:细胞组分;C:分子功能。

KEGG富集分析共得到富集通路186条,将结果显著性较强的前20条信号通路进行展示(图5)。其中与马齿苋抗ACD相关性靠前的通路涉及癌症通路(pathways in cancer)、脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway)、TNF信号通路(signaling pathway),IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等,这些通路大多与RELA、JUN、TNF、MAPK1等有关。

图5 KEGG富集结果图

为了将有效成分、核心靶标与通路之间的关系更清晰地展现出来。利用Cytoscape 3.9.0软件将马齿苋中的成分、共有靶点进行网络可视化分析,通过网络药理学构建马齿苋抗ACD的交互网络,筛选出相应的交互蛋白,其中蓝色代表二者的共有靶点,黄色代表化学成分,共10个,红色代表药物,通过构建药物-成分-靶点网络图,可更直观更清晰地看出各成分对应的靶点调控,如图6所示。

图6 化学成分-靶点-疾病网络图

2.5分子对接结果基于PPI网络和KEGG富集分析结果,选择马齿苋与ACD共有靶点中综合排名前3的关键靶点(RELA、JUN和TNF)进行分子对接,针对这些靶点的活性成分进行分子对接验证,以总分≥5为筛选条件,筛选出对接结果较好的化学成分,总计分越高说明结合更稳定。最后将对接结果较好的化学成分和蛋白晶体进行可视化,结果如图7所示,结合成分分子的关键靶标的氨基酸残基清晰地呈现出来,氢键用虚线表示。所有化合物的对接评分如图8所示,结果发现,β谷甾醇、花生四烯酸、异甜菜素、环阿屯醇、5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one 5个化合物可能在抗ACD中发挥重要作用。

图7 分子对接可视化

图8 分子对接评分

3 讨论

中医药一直以多成分、多靶点的特点在各类疾病中发挥防治作用,对于过敏性皮肤病的治疗更具有一定的方法和经验。马齿苋作为常见的药食两用药材,具有抗炎、调节免疫、抗氧化、神经保护等多重药理作用,临床用药表明[9-10]马齿苋对于过敏性皮肤病,如湿疹、特应性皮炎等有着良好的治疗作用,但相关机制研究较少,且对于ACD的作用分子机制尚未得到阐明。网络药理学可以通过复杂的PPI网络图表达药物化学成分-靶点-疾病之间的关系,与多成分、多靶点、多功能的中医特色相互吻合。因此,本文运用网络药理学和分子对接的研究手段,就马齿苋抗ACD的作用物质基础和潜在作用靶点进行探讨。

3.1马齿苋治疗ACD的重要靶点从PPI网络分析结果来看,在马齿苋抗ACD中,RELA、JUN、TNF、STAT1、IL-6、IL-10、AKT1、TP53、MAPK1、FOS 10大靶点扮演着重要角色。其中RELA(NF-κB p65)、JUN、TNF是排名前3的关键靶点。研究表明RELA的激活可诱导越来越多的靶基因,涉及多种生物活性,包括细胞生长、存活和免疫反应[9]。RELA作为ACD发生过程中的关键环,当皮肤接触到如镍离子、钴离子等刺激物时能直接激活toll样受体4(toll-like receptors4,TLR4),与下游的RELA形成联动,诱导促炎因子及趋化因子释放,介导皮肤发生严重的炎症反应[10]。研究表明JUN是能通过多条途径参与机体炎症反应的关键靶点,比如哮喘、肝损伤等[11-12]。有研究指出[11]JUN能激活紧密连接蛋白之一CLDN1的启动子活性,对维护皮肤正常屏障功能,降低过敏反应发生起重要作用,当JUN受到抑制时,紧密连接的降低可能会导致过敏反应的发生。在ACD致敏初期,TNF可促使表皮Langhans细胞迁移至引流淋巴结,引起皮肤发炎,且研究显示[12]TNF的感受器可促使抗原吸收树突状细胞,加重过敏反应的发生。

3.2马齿苋治疗ACD的重要化学成分由本研究分子对接显示,马齿苋抗ACD的主要核心成分有环阿屯醇、β-谷甾醇、异甜菜素、花生四烯酸等。β-谷甾醇是一种具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、愈合创面等多重药理作用的天然成分,研究表明[13]β-谷甾醇能调节NF-κB以及JUN信号通路,调节炎症因子TNF-α,IL-6生成,抑制炎症反应发生。此外,研究显示[14-15]β-谷甾醇可通过降低胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)来减弱类似特应性皮炎样皮肤病变。有研究指出[14]异甜菜素具有明显的抗氧化活性,而致敏物质会促进Keap1半胱氨酸残基氧化,促进Nrf2-Keap1复合物解离,Nrf2易位到细胞核,调节抗氧化剂和异源代谢酶基因,减少Nrf2在角质形成细胞中的表达,促进氧化应激反应发生[15],可以推测异甜菜素可能存在通过调节氧化应激治疗ACD的可能。环阿屯醇是经证实具有抗菌、抗肿瘤作用的三酰胺类化合物,是一种抗菌、抗肿瘤药物[16]。研究表明[17]环阿屯醇能抑制体外DC细胞成熟、诱导T细胞分化、促进Treg细胞增加、降低Th17细胞、平衡IL-17+RORγt+/IL-10+FOXP3+比值,从而达到改善慢性炎症性皮肤病的效果。

3.3马齿苋治疗ACD的关键生物通路通过GO富集分析可知,马齿苋在脂多糖的反应,细菌起源分子反应,细胞对脂质的反应等方面具有特异性作用。KEGG通路富集结果表明,马齿苋抗ACD的作用通路涉及癌症通路,脂质和动脉粥样硬化,流体剪切应力和动脉粥样硬化,AGE-RAGE信号通路,TNF信号通路等。在KEGG网络中发现,癌症通路涉及范围广泛,包括常见的HIF-1信号通路、P38MAPK信号通路以及VEGF信号通路等。已知在过敏性皮炎中,IL-1β、TNF-α等炎性因子可参与皮肤屏障功能的调节,HIF-1α可被相关炎性因子激活,加重炎性反应,也可增加TSLP在角质细胞中的表达,抑制HIF-1α,能有效改善CLDN1低表达及TSLP、IL-33释放[18]。有研究表明[19]致敏剂DNFB应用于皮肤能刺激DC,激活P38MAPK信号通路,诱导ACD炎症反应发生。此外,有临床研究显示[20]过敏性皮炎患者皮肤角质层中VEGF含量高达正常皮肤25倍,与皮肤的炎症强度息息相关。TNF信号通路的活化能刺激NF-κB和MAPK信号传导,促进IL-6、IL-1β等炎症因子表达[21],也有文献指出[22]脂质与动脉硬化通路也可以激活IL-6、TNF-α等炎性因子,液体剪切应力和动脉粥样硬化通路同样对NF-κB信号传导起激活效用,除了促进IL-1、TNF-α分泌外,还能激活VEGF生成,对ACD发生发展起重要作用。AGE-RAGE通路参与了包括心血管疾病、糖尿病、癌症和神经退行性疾病在内的多种疾病的发生过程,AGE-RAGE可引发氧化应激和炎性反应,介导下游的NF-κB活化,并提高了IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,以及生长因子(如VEGF)的表达[23-24]。

综上所述,马齿苋可能主要作用于RELA、JUN、TNF、STAT1、IL-6等核心靶点,通过环阿屯醇、β-谷甾醇、异甜菜素、花生四烯酸等活性成分,通过癌症、脂类与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、AGE-RAGE、TNF等信号通路,协同作用于ACD的治疗。相关结论可以为马齿苋治疗ACD的作用机制的研究提供新的思路,为ACD临床用药开发提供更多的理论依据。