生品与麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠及胰腺磷酸化钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ的影响

谢慧臣,罗丽华,吴广阳

1.湖北民族大学(湖北 恩施 445000) 2.恩施自治州中心医院(湖北 恩施 445000)

麸炒法是中药传统炮制方法,历代本草专著多有记载,用料常是麦麸或麸皮。苍术具有健脾、祛风、燥湿等功效,但麸炒后的苍术与生苍术功效差异较大,说明苍术麸炒法可明显改变苍术的化学成分及含量[1]。查阅文献后,发现目前关于苍术炮制前后药理作用差异机理的研究尚不足[2]。本实验通过创建脾虚大鼠模型,从结肠、胰腺组织磷酸化钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)信号通路入手,以期阐明苍术麸炒后较生品健脾作用增强的机理,为后续麸炒苍术健脾作用机制的进一步研究及临床应用打下一定的基础。

1 材料与方法

1.1动物、仪器、药物与试剂雄性SD大鼠70只,3～4月龄,体质量(150±20)g,购自武汉塞维尔生物科技有限公司,许可证号SYXK(鄂)20180101,常规喂养,自由进食水。中药均购自湖北省恒信医药有限公司。小承气汤方厚朴、大黄、枳实的组方比例为5∶4∶3,共5kg,生苍术和麸炒苍术各5kg,小承气汤方、生苍术和麸炒苍术分别常规煎煮2次,每次45min,分别滤出药液合并再浓缩,小承气汤方浓缩液含生药浓度6g/mL,生苍术和麸炒苍术浓缩液含生药浓度2.0g/mL,低温保存。磷酸化钙调p-CaMKⅡ抗体(货号:ab23514)由武汉塞维尔生物科技有限公司提供;RNA提取液(货号:J253479)由Servicebio提供,引物由Thermo提供;引物序列见表1。

表1 引物序列信息

Stepone plus GC-1500型荧光定量PCR仪(ABI);Adobe PhotoShop图像分析软件(Adobe);AutoLumo A2000Plus化学发光仪(郑州安图生物工程股份有限公司);NE600光学显微镜(西尼科光学仪器有限公司)。

1.2动物分组、造模与给药70只大鼠随机分为正常组、模型组、复方谷氨酰胺组、生苍术及麸炒苍术高、低剂量组。苦寒破气与饥饱失常法建立脾气虚大鼠模型[3-4],除正常组外的其余6组大鼠每日灌服苦寒破气方1次,剂量为生药10mL/kg体质量,隔日喂饲1次,剂量减半,共计21d。造模结束后即灌胃治疗。苍术与复方谷氨酰胺每日用量根据成人每日用量,通过体表面积公式换算得到苍术麸炒前后高、低剂量组大鼠每日用量分别为10、2.5mL/kg,复方谷氨酰胺9mg/kg,治疗前蒸馏水配制成溶液2mL灌胃,正常组、模型组每日给予生理盐水2mL灌胃,持续治疗14d。

1.3观察指标与方法

1.3.1 观察结肠、胰腺组织病理学改变 治疗期满后,水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏采血6mL,离心后取上清液低温保存,取结肠、胰腺一部分4%多聚甲醛固定,脱水、石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察结肠、胰腺病理学改变。

1.3.2 激光共聚焦法检测大鼠结肠、胰腺组织细胞中Ca2+表达水平 将冷冻结肠、胰腺组织取出切片,冲洗,染色,孵育,封片,根据Cal-520©钙荧光指示剂说明书操作,对标本荧光标记,激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度并连续摄片,图像分析系统测定荧光强度并分析。

1.3.3 免疫组化法检测大鼠结肠、胰腺磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)蛋白分布及表达 另取结肠、胰腺一部分4%多聚甲醛固定,脱水、石蜡包埋、切片,按照免疫组织化学SABC法步骤操作,观察模型大鼠结肠、胰腺p-CaMKⅡ蛋白表达,具体操作按说明书进行,结果以平均光密度值表达。

1.3.4 实时荧光定量PCR法检测各组大鼠结肠、胰腺组织中p-CaMKⅡ基因表达 取匀浆管,加入1mL Trizol Reagent,取100mg组织,匀浆,离心取上清,异丙醇混匀,离心,乙醇洗涤,加水溶解RNA,取10μL RNA溶液,加入逆转录酶,配制反应体系,反转录产物PCR扩增。采用ΔΔCT法,即2-K计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织病理学的影响光镜下可见正常组大鼠结肠形态组织学无明显异常,黏膜光滑,细胞排列整齐,肠腺丰富,无炎性细胞浸润(图1A),胰腺组织胰岛数较多,岛内细胞丰满,结构清楚,排列整齐(图2A);模型组大鼠结肠黏膜水肿破坏较严重,炎性渗出及炎症细胞浸润,腺体排列紊乱,肉芽组织增生(图1B),胰腺组织胰岛数明显减少,细胞分布不均,岛内细胞大量呈空泡状,结构模糊,排列紊乱(图2B);与模型组比较,生苍术低剂量组光镜下可见结肠黏膜及胰腺组织微观结构改善不明显(图1F、2F),其余各治疗组光镜下可见结肠腺体结构、粘膜层、粘膜下层结构不同程度修复,炎症细胞浸润显著减少(图1C-1E,1G),胰腺组织中胰岛数及岛内细胞数不同程度回升,空泡状细胞不同程度减少,细胞分布渐趋均匀,核大小渐趋一致(图2C-2E,2G),其中麸炒苍术高剂量组修复最为明显。

A:正常组;B:模型组;C:复方谷氨酰胺组;D:麸炒苍术低剂量组;E:麸炒苍术高剂量组;F:生苍术低剂量组;G:生苍术高剂量组。图1 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠组织病理学的影响(HE染色,×200)

A:正常组;B:模型组;C:复方谷氨酰胺组;D:麸炒苍术低剂量组;E:麸炒苍术高剂量组;F:生苍术低剂量组;G:生苍术高剂量组。图2 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠胰腺组织病理学的影响(HE染色,×200)

2.2生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织细胞中Ca2+荧光值的影响与正常组比较,模型组结肠组织细胞Ca2+荧光值升高,胰腺组织细胞Ca2+荧光值降低(P<0.01);与模型组比较,麸炒苍术高、低剂量组、生苍术高剂量组和复方谷氨酰胺组结肠组织细胞Ca2+荧光值降低,胰腺组织细胞Ca2+荧光值升高(P<0.05或P<0.01);与复方谷氨酰胺组比较,麸炒苍术高剂量组结肠组织细胞Ca2+荧光值降低,胰腺组织细胞Ca2+荧光值升高(P<0.05或P<0.01);与生苍术高剂量组比较,麸炒苍术高剂量组结肠组织细胞Ca2+荧光值降低,胰腺组织细胞Ca2+荧光值升高(P<0.01),见表2,图3、图4。

A:正常组;B:模型组;C:复方谷氨酰胺组;D:麸炒苍术低剂量组;E:麸炒苍术高剂量组;F:生苍术低剂量组;G:生苍术高剂量组。图3 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠组织细胞中Ca2+表达水平的影响(荧光图,×400)

A:正常组;B:模型组;C:复方谷氨酰胺组;D:麸炒苍术低剂量组;E:麸炒苍术高剂量组;F:生苍术低剂量组;G:生苍术高剂量组。图4 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠胰腺组织细胞中Ca2+表达水平的影响(荧光图,×400)

表2 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织细胞中Ca2+浓度的影响

2.3生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织中p-CaMKⅡ蛋白表达的影响与正常组比较,模型组结肠组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平升高,胰腺组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平降低(P<0.01);与模型组比较,麸炒苍术高、低剂量组、生苍术高剂量组和复方谷氨酰胺组结肠组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平降低,胰腺组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01);与复方谷氨酰胺组比较,麸炒苍术高剂量组结肠组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平降低,胰腺组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01);与生苍术高剂量组比较,麸炒苍术高剂量组结肠组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平降低,胰腺组织p-CaMKⅡ蛋白表达水平升高(P<0.01),见表3。

表3 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织中p-CaMKⅡ蛋白表达的影响

2.4生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织中p-CaMKⅡ基因表达的影响与正常组比较,模型组结肠组织p-CaMKⅡ基因表达升高,胰腺组织p-CaMKⅡ基因表达降低(P<0.01);与模型组比较,麸炒苍术高、低剂量组、生苍术高剂量组和复方谷氨酰胺组结肠组织p-CaMKⅡ基因表达水平降低,胰腺组织p-CaMKⅡ基因表达水平升高(P<0.05或P<0.01);与复方谷氨酰胺组比较,麸炒苍术高剂量组结肠组织p-CaMKⅡ基因表达水平降低,胰腺组织p-CaMKⅡ基因表达水平升高(P<0.05或P<0.01);与生苍术高剂量组比较,麸炒苍术高剂量组结肠组织p-CaMKⅡ基因表达水平降低,胰腺组织p-CaMKⅡ基因表达水平升高(P<0.01),见表4。

表4 生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠结肠、胰腺组织中p-CaMKⅡ基因表达的影响

3 讨论

目前脾虚证动物模型的制备多采用与临床真实环境更加接近的多因素复合造模方法,综合相关文献[5-6],本研究采用苦寒破气加饥饱失常法构建脾虚证模型。实验结果发现光镜下模型大鼠结肠黏膜水肿破坏较严重,炎性渗出及炎症细胞浸润,腺体排列紊乱,结构模糊,胰腺组织胰岛数明显减少,细胞分布不均,说明上述脾虚证造模方法的科学性。而生苍术和麸炒苍术均能不同程度改善模型大鼠结肠和胰腺组织结构,且麸炒苍术与生苍术比较,疗效更为突出,其中尤以麸炒苍术高剂量组改善最为显著。

细胞内Ca2+作为重要的调节介质和第二信使,参与细胞的能量代谢,对细胞的生存和凋亡具有重要影响。CaMKⅡ是重要的Ca2+信号介导分子,参与细胞的形态、凋亡、迁移、兴奋收缩偶联等多种细胞调节功能,有研究表明[7]Ca2+/CaMKⅡ信号通路与中医“脾”的功能关系密切,目前常常把Ca2+/CaMKⅡ通路活性变化作为测试脾虚证治疗效果的重要指标。蛋白磷酸化和去磷酸化参与调节细胞活动的各个方面。研究发现[8]磷酸化CaMKⅡ可通过一定的通路调节胃肠平滑肌,使大鼠胃窦平滑肌松弛,调节和改善胃肠动力。本实验结果表明,脾虚证大鼠结肠组织p-CaMKⅡ蛋白和基因表达升高,表明脾虚证大鼠肠道Ca2+/CaMKⅡ信号传导通路可被代偿性激活,而脾虚大鼠胰腺细胞由于能量代谢低下,导致其分泌功能出现障碍,抑制了大鼠胰腺细胞CaMKⅡ的表达[9]。而生品和麸炒苍术可降低结肠组织p-CaMKⅡ蛋白和基因表达,表明苍术可通过下调p-CaMKⅡ表达,抑制肠道平滑肌细胞的收缩和痉挛,调节正常的胃肠激素分泌,促进胃肠平滑肌正常蠕动,并调控相关胃肠激素及抑炎或促炎因子正常分泌。同时上调胰腺p-CaMKⅡ的表达,表明苍术可使胰腺组织中Ca2+/CaMKⅡ信号通路中的p-CaMKⅡ等关键信号分子被激活,促使胰腺功能恢复正常,且不同剂量麸炒苍术疗效均优于同剂量的生苍术,其中尤以麸炒苍术高剂量组疗效最为明显,与生苍术高剂量组比较具有显著性差异。提示麸炒苍术可更好的通过Ca2+/p-CaMKⅡ信号通路调节脾虚大鼠结肠和胰腺功能,促进临床疗效。