疏肝健脾益肠方对肝郁脾虚型银屑病小鼠相关炎性细胞因子释放的影响

张 华,郑 露,2,刘 欢,周奕敏,涂 星*

1.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000) 2.武汉钢铁(集团)公司第二职工医院康复科(湖北 武汉 430085)

银屑病(psoriasis,PS)是一种病程较长,易反复发作,以红斑、鳞屑等为主要临床表现的慢性免疫介导型皮肤病,其主要症状为瘙痒和疼痛,常夜间加重,严重影响患者的睡眠质量,从而给患者的身心健康和日常生活带来极大影响[1-3]。促炎性细胞因子是血管内皮细胞合成和释放的可以激活炎症反应的因子,如干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-23(IL-23)、白介素-17(IL-17)等,它们在细胞毒和局部炎症相关免疫应答过程中起主要介导参与作用,能引起细胞免疫和迟发型超敏性炎症,是PS发生的重要因素[4]。

古代医家早期针对PS的致病因素和发病机制多从“外感风寒湿热等邪气所致”来认识,进一步发展成“脏腑病变、气血失调等内在病理机制与外感诸邪气合而致病”,整体上紧密围绕“血”与“风”两大特点,如《医宗金鉴》有云:“固有风邪客肌肤,亦有血燥难荣外”。近现代医家根据长期科学研究以及丰富的临床实践经验,对PS病因病机有了进一步的深化拓展,其中“血分论治”PS最为常见,然而PS作为一个发病机制复杂的顽固性皮肤病,其中医的辨证论治并非一成不变,需要结合患者具体病情辨证施治。针对部分患者由于体质差异、病情阶段、药食影响等因素从血分论治效果不佳的情况,部分医家提出以脏腑辨证为核心。如艾儒棣教授从脾胃论治,认为其病机是脾虚为本,湿毒为标[5]。在古今医家理论研究基础上,结合当今社会生活节奏的加快、现代人饮食结构改变以及心理压力等不良情绪增加等因素,本研究提出“肝郁脾虚”所引起的肠燥、肠虚、湿热蕴藏等可能是PS发生的主要病机之一,而对于其治疗,可相应采取疏肝健脾法以治其本,润肠通便、补虚润肠、清热解毒等以治其标;通过探究疏肝健脾益肠方对调节肝郁脾虚型PS小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-23和IL-17水平变化,研究疏肝健脾益肠方对PS小鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1实验动物40只雄性无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级昆明小鼠(kunming mice,KM小鼠),5～7周龄,体质量18～22g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司,生产许可证号:SCXK(辽)2020-0001,质量合格证编号:NO.210726210101125034。湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心,实验室提供清洁级动物房,温度20±2℃,相对湿度50%～70%。

1.2动物分组将KM小鼠适应性喂养1周后称重,采用随机数字表法将40只小鼠分为正常组、模型组、疏肝健脾益肠方高、中、低剂量组5组,每组8只。

1.3实验药品与试剂凡士林软膏(南昌白云药业有限公司,赣食药准字F20050006);咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司,国药准字H20030129);脱毛膏[利洁时家化(中国)有限公司,国妆特字G20161330];冰醋酸(分析纯,天津市福晨化学试剂厂,批号20160220);4%多聚甲醛(Biosharp Life sciences,批号1807231);二甲苯(国药集团化学试剂有限公司,批号20180607);石蜡(Leica Biosystems,批号1805139);苏木素-伊红(苏州泽科生物技术有限公司,批号ZKP-E15006-1);ELISA试剂盒(武汉博士德有限公司);PBS(北京普利莱基因技术有限公司);其他试剂均为分析纯。

疏肝健脾益肠方煎液:由柴胡、当归、白芍、白术(麸炒)、茯苓、防风、砂仁、木香、甘草(蜜炙)、党参、黄芪、生地黄、蝉蜕、地肤子组成,均购于湖北强康中药饮片有限公司,生药140g。首次煎熬1.5h,加1100mL水,第二次煎熬0.5h加420mL,将两次煎液混合,滤过后,经减压浓缩,最终浓缩至含有生药2.8g/mL的药液。

1.4主要实验仪器XSR105/AC电子分析天平(梅特勒公司),Mili-Q Direct-Q5UV超纯水机(美国密理博公司),KQ500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);S1200 Smartpipette型全自动移液器(量程50～1200μL,Ronlabs公司),制冰机(上海化朗仪器有限公司);TC-120型智能程控生物组织自动脱水机(泰维科技实业股份有限公司);TB-718E型生物组织自动包埋机(泰维科技实业股份有限公司);R139型轮转式切片机(泰维科技实业股份有限公司);TK-218Ⅱ型摊片机(泰维科技实业股份有限公司);BX53型偏光显微镜(奥林巴斯);5810R高速冷冻离心机(Eppendorf公司);酶标定量测定仪(Thermo Scientific公司);海尔立式超低温冰箱等。

1.5肝郁脾虚型PS小鼠模型的建立与评价根据文献[6]采用5%咪喹莫特乳膏涂抹诱导PS。正常组小鼠每日口服蒸馏水,模型组及疏肝健脾益肠方组小鼠每日口服醋酸(0.03mol/L冰醋酸),同时使用胶带进行束缚应激操作;7d后,用脱毛膏在各组小鼠背部脱毛,暴露2cm×2cm的无毛区,脱毛后正常组小鼠每日继续口服蒸馏水,并配合背部无毛区均匀涂抹凡士林软膏62.5mg,1次/d,模型组及疏肝健脾益肠方组小鼠每日继续醋酸口服刺激(0.03mol/L冰醋酸)及胶带束缚应激,同时背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg,1次/d,连续14d,共21d,进行束缚应激和口服醋酸刺激操作开始,进行小鼠中医证候特征评价,分值越低表明肝郁脾虚证候特征越明显(表1)。自抹药开始,采用PASI评分[7]进行评估,以小鼠背部皮肤出现红斑、鳞屑、浸润改变表明PS造模成功。观察指标及评分细则见表2。

表1 小鼠的行为观察指标

表2 PASI评分

1.6实验动物治疗造模结束后,正常组、模型组各自用蒸馏水0.1mL/10g灌胃,疏肝健脾益肠方高、中、低剂量组则依次按照17.6、8.8、4.4mL/kg的剂量给予疏肝健脾益肠方煎液灌胃,1次/d,连用21d,小鼠给药剂量根据《中药药理研究方法学》[8]中人与小鼠体表面积比例进行换算。

1.7各组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17含量末次给药24h后,对各组小鼠进行眼球取血,将血液放入抗凝管中,经离心分离后,将上清液装入-80℃冰箱中备用,采用ELISA法检测IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-23、IL-17在血清中的含量,详细操作参考ELISA试剂盒。

1.8皮肤组织病理切片观察末次给药24h后,采取颈椎脱臼法处死小鼠后取小鼠无毛区皮肤组织浸泡于4%多聚甲醛固定,脱水,用石蜡加以包埋,切片,使用常规HE染色,最后在光学显微镜下观察各组小鼠皮肤组织的病理学特征。

2 结果

2.1肝郁脾虚型PS小鼠皮损的形态学变化造模前,观察各组小鼠的皮肤损伤情况,其PASI评分都为0。由表3可知,除了正常组之外,使用5%咪喹莫特涂抹小鼠背部表皮后,会导致不同程度的红斑、鳞屑和浸润等现象,小鼠PASI评分提高(P<0.05);疏肝健脾益肠组给药后小鼠背部的红斑、鳞屑、浸润等皮损情况好转,PASI评分下降,但同时模型组的小鼠皮损情况好转,考虑为小鼠的自愈性所致;小鼠PASI评分情况来看,无法判断疏肝健脾益肠方的剂量是否与PS的治疗有剂量依赖,见表3。

表3 疏肝健脾益肠方对各组小鼠皮肤PASI评分的影响分)

2.2皮损组织病理变化正常组小鼠皮肤结构完好,表皮和真皮分界清晰,角质层较薄,颗粒层清晰;模型组小鼠表皮显著增厚,可见不同程度的角质层增生伴有角化不完全,表皮突起明显下延,棘层增厚,颗粒层变薄;高、中、低剂量组小鼠皮肤病理变化和模型组类似,但是表皮增厚、角化不全、棘层增厚、颗粒层变薄等都比模型组要轻,特别是高剂量组的皮肤病理改善最为显著,见图1。

A:正常组;B:模型组;C:高剂量组;D:中剂量组;E:低剂量组。图1 小鼠皮肤组织病理切片图(HE,×200)

2.3血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17含量的变化与正常组比较,PS模型小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17的含量均显著上升(P<0.05);与模型组相比,疏肝健脾益肠方高、中、低剂量组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17含量均显著下降(P<0.05);与疏肝健脾益肠方高剂量组相比,中、低剂量组IFN-γ的含量明显升高,且中剂量组降低IFN-γ的含量较低剂量组更为显著(P<0.05);与疏肝健脾益肠方低剂量组相比,高、中剂量组的IL-23及IL-17含量下降效果优于低剂量组(P<0.05),见表4。

表4 各组小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17检测结果的影响

3 讨论

PS是一种典型的皮肤病症,其特点是过度增殖的角质形成细胞,这些细胞是在表皮占比最多的细胞类型,可以感知病原体并介导免疫反应,在皮肤暴露于抗原后,角质形成细胞中炎症小体复合物中所含的细胞内传感器被激活,促进炎症因子的产生,进而活化免疫细胞,从而诱导和维持炎症反应[9]。目前已知,TNF-α、IFN-γ和IL-23/Th17细胞等相关的细胞因子和通路在PS发病机制中扮演着至关重要的角色[10]。TNF-α是一种拥有广泛生物活性的细胞因子,它参与了人体的免疫反应,并能加速PS的炎症反应以及表皮细胞的增殖[11]。IFN-γ主要来源于T细胞和NK细胞,它参与并维持PS的炎性浸润,是引起角质形成细胞异常增殖的主要因素,并参与了T细胞向表皮的增殖[12]。Th17及与之有关的细胞因子在PS的发病中起着重要作用,在PS患者的血液中,Th17及它的下游效应因子IL-17A、IL-17F和TNF-α等均有明显升高[13]。IL-23能促进Th17细胞产生大量的炎性因子IL-17,IL-17能诱导促炎细胞因子(IL-6、TNF-α等)以及相关细胞因子的表达,导致炎性细胞的浸润,促进皮损的形成和发展,从而导致PS[14]。

在记载了中国传统医学的相关古代典籍中,关于PS病名,目前尚没有具体的描述,因其“肤如疹疥,色白而痒,搔起白皮”,多称其为“白疕”。而关于PS的病因病机,部分医家认为“肝郁脾虚”是PS的主要病机之一,其发生可能与肠燥、肠虚、肠道湿热等有关。肝和脾在生理上相互为用,在病理上相互影响。肝主藏血,其藏血功能失常可能导致气血失和,肌肤失养;肝主疏泄,情志所伤导致肝气郁结,日久肝郁化火横逆犯胃,阴津受损,易致肠道干燥,故PS皮肤多干燥、瘙痒。脾为后天之本、气血生化之源,脾主升清,盛津液,行水湿。肝气郁结易致脾虚,脾虚易致小肠受盛化物能力下降,导致肠道虚弱,脾虚生痰,故临床上患者皮损多见白色鳞屑肥厚等痰湿之象;痰湿郁久化热,易致大肠湿热,湿热蕴阻肌肤,郁滞气血,故PS多表现红斑症状。疏肝健脾益肠方对于PS,尤其是肝郁脾虚肠燥型有良好的疗效,可缓解瘙痒、减轻患者的皮肤损伤程度,对于脾虚、肠燥、便秘等临床症状有一定的改善作用。因此,采用疏肝健脾益肠方对PS加以治疗,其疗效是肯定的。

在本研究中,肝郁脾虚型PS模型小鼠血清中促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-23、IL-17的含量显著增加(P<0.05),给予疏肝健脾益肠方后,血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17含量均显著下降(P<0.05),表明疏肝健脾益肠方可以抑制血清中IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17的表达,并且可能与疏肝健脾益肠方的给药浓度有关。病理结果显示相同结果,表明疏肝健脾益肠方能够有效地抑制PS角质形成细胞过度的增殖、分化及炎症细胞浸润,从而减轻皮肤的炎症反应,进而达到治疗PS的目的。在未来的临床研究中,将会不断地探索疏肝健脾益肠方治疗肝郁脾虚型PS的作用机制,以期为临床提供安全、可靠、疗效确切、经济的治疗PS的药物。