桃叶珊瑚苷在烟曲霉菌角膜炎中抗炎作用及其机制

刁玮琳,尹敏,李翠

(青岛大学附属医院眼科,山东 青岛 266003)

真菌性角膜炎是最严重的感染性角膜病之一,其发病率持续上升[1]。烟曲霉菌(AF)是角膜感染的主要真菌病原体,角膜上皮损伤是角膜炎的关键诱发因素[2]。真菌侵入角膜基质层时诱发的免疫反应导致进一步的组织损伤[3]。桃叶珊瑚苷(AU)存在于许多天然植物中[4],具有广泛的药理学特性,如抗炎、抗菌、抗氧化、神经保护以及抗纤维化等作用[5-9]。研究显示,AU能够降低干眼症小鼠白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-8(IL-8)等炎症因子表达预防角膜上皮损伤[10],AU通过TOLL样受体4/髓样分化因子88/人核因子κB抑制蛋白α/核因子κB信号通路抑制脊髓损伤模型中的炎症,从而促进神经元功能恢复[11];AU通过抑制肌醇依赖酶1α/硫氧还蛋白互作蛋白信号通路缓解炎症反应,从而延缓2型糖尿病诱导的肝纤维化发展[12]。因此,AU具有抗炎潜力并且可能成为治疗真菌性角膜炎的药物。本研究探讨AU对AF诱导的真菌性角膜炎炎症反应的作用。

1 材料和方法

1.1 真菌制备

AF标准菌株(菌株3.0772,中国微生物中心)于固体琼脂培养基中培养,振荡研磨后收集菌丝,以12 000 r/min离心15 min,用无菌PBS洗涤。将收集的活化菌丝用于动物实验;用体积分数0.70乙醇处理灭活菌丝,并将浓度调整为3×1011CFU/L用于细胞实验。

1.2 细胞培养与刺激

人角膜上皮细胞(HCECs)由中国福建厦门大学实验室提供。将HCECs接种于6孔板或者12孔板之中,在含有胎牛血清的F12细胞培养液中37 ℃培养,至细胞生长密度达到80%,将细胞分为DMSO组、AU组、AF+DMSO组、AF+AU组,其中DMSO组与AU组分别加入含有体积分数0.005 DMSO和20 mg/L AU的细胞培养液培养;AF+DMSO组与AF+AU组分别加入体积分数0.005 DMSO和20 mg/L的AU预处理2 h后,加入灭活菌丝。收集菌丝刺激8 h后的细胞进行RT-PCR,收集刺激24 h的细胞进行Western blot和ELISA检测。

1.3 检测指标及方法

1.3.1药物细胞毒性评估 将HCECs接种于96孔板中,分别加入含有不同浓度AU(5、10、20、40、80、160、320 mg/L)细胞培养液,37 ℃下培养24 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂(Solarbio,中国北京)后培养2 h,用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值,以其评估各组细胞存活率。

1.3.2小鼠AF角膜炎模型的建立及AU对其作用健康8周龄雌性C57BL/6小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,所有治疗均符合视觉与眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明要求。在正常小鼠右眼中分别滴入体积分数0.005的DMSO(DMSO组)以及20 mg/L的AU(AU组)5 μL,每天2次。选取小鼠的右眼作为实验眼,80 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后刮取小鼠右眼中央2 mm角膜上皮,在眼表面涂抹AF(5 μL,3×1011CFU/L),放置软接触镜后缝合眼睑24 h以形成溃疡。眼睑缝线拆除后,分别将体积分数0.005的DMSO及20 mg/L AU 5 μL滴入小鼠结膜囊,每天2次,分别作为AF+DMSO组及AF+AU组。感染后第1天和第3天,裂隙灯下观察小鼠角膜炎严重程度,参考相关文献进行临床评分评估角膜炎严重程度[13],根据溃疡面积、混浊程度和溃疡形态分为Ⅰ～Ⅳ级,分别对应1～4分。临床评分总分为3项观察指标分数相加,总分0～5为轻度感染,6～9为中度感染,10～12为严重感染。收集各组小鼠角膜用于实时荧光定量PCR(RT-PCR)、Western blot、ELISA和髓过氧化物酶(MPO)实验,收集小鼠眼球用于免疫荧光染色。

1.3.3RT-PCR检测相关受体与炎症因子mRNA表达 使用RNAiso Plus试剂盒(Takara,大连,中国)从灭活AF菌丝刺激8 h后的HCECs或小鼠角膜中提取总RNA,使用Prime Script RT试剂盒(Takara,大连,中国)将RNA逆转录获得cDNA,用RT-PCR仪器(Eppendorf公司,德国)进行PCR扩增反应。PCR反应体系:目的基因上、下游引物各0.5 μL,SYBR 10.0 μL,样本cDNA 2.0 μL,灭菌DEPC水7.0 μL。根据循环数计算基因的相对表达量,以β-actin作为内参照,分别检测重组与合成蛋白(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)、IL-1β以及白细胞介素-6(IL-6)mRNA表达。PCR引物及其序列见表1。

表1 PCR引物及其序列

1.3.4Western blot检测Nrf2和HO-1蛋白表达用比例为98∶1∶1的RIPA缓冲液、PMSF和磷酸酶抑制剂的混合液裂解细胞蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio,中国北京)测定蛋白质的浓度后,应用体积分数0.10 SDS-PAGE分离总蛋白质,转移到PVDF膜上。用封闭液(beyotime,中国北京)封闭膜,并将膜分别浸泡于一抗Nrf2(1∶1 000, CST)、HO-1(1∶20 000, Abcam)、β-actin(1∶1 000, Elabscience)和 β-tubulin(1∶1 000, Elabscience)中4 ℃孵育过夜,用PBST洗涤3次后,将膜与相应的二抗(1∶1 000, Elabscience)37 ℃下孵育1 h,于UVP(VILBER LOURM,美国)下显像并拍照。应用Image J软件分析各组蛋白条带的灰度值,以其表示蛋白表达水平。

1.3.5ELISA方法检测IL-1β、IL-6蛋白表达 灭活AF菌丝刺激HCECs 24 h,离心并收集细胞上清液,应用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6蛋白表达水平,按试剂盒说明书进行操作。使用酶标仪检测450 nm和570 nm波长处的吸光度值,根据标准蛋白曲线计算各组样本蛋白表达浓度。

1.3.6免疫荧光染色检测AU对中性粒细胞募集的影响 收集小鼠感染第3天的眼球置于OCT包埋剂中液氮冷冻,-25 ℃下切成8 μm厚的连续切片,4 ℃下用丙酮固定5 min。加入山羊血清(1∶100,Solarbio)封闭30 min后,在4 ℃下用NIMP-R14(1∶100,Santa Cruz Biotechnology Company)孵育样本过夜。加入相应的二抗(1∶200,Elabscience)避光孵育1 h,DAPI染色10 min。荧光显微镜(Zeiss Axio Vert,放大倍数400倍)观察并拍照,观察样本中性粒细胞的定位。

1.3.7MPO实验检测中性粒细胞MPO活性 收集小鼠感染第3天角膜,应用MPO试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国江苏)检测各组样本MPO活性,按试剂盒说明书步骤进行操作。在37 ℃下用酶标仪测量460 nm处吸光度值,以其作为MPO活性结果。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 AU对细胞的毒性评估

CCK-8实验显示,各处理组之间HCECs存活率差异有统计学意义(F=11.696,P<0.05)。浓度为80、160、320 mg/L的AU处理降低了HCECs存活率(P<0.05),浓度≤40 mg/L的AU处理对HCECs存活率无影响(P>0.05)。见表2。

表2 不同浓度AU对HCECs细胞存活率的影响

2.2 AU对AF性角膜炎的严重程度和中性粒细胞的影响

裂隙灯观察显示,与AF+DMSO组相比,感染第3天AF+AU组小鼠角膜溃疡面积减少,混浊程度减轻(图1A～D)。重复测量设计方差分析显示,时间、组别、时间与组别的交互作用对临床评分均有影响(F时间=91.207,F分组=16.200,F时间×分组=20.862,P<0.01)。单独效应分析显示,感染第1天AF+AU组与AF+DMSO组临床评分差异无统计学意义(F=0.385,P>0.05);感染第3天AF+AU组临床评分较AF+DMSO组降低,差异有统计学意义(F=35.714,P<0.001);感染第3天AF+DMSO组、AF+AU组小鼠临床评分与第1天相比均明显提高(F=99.655、12.414,P<0.01)。见表3。免疫荧光染色检测显示,AF+AU组小鼠角膜中性粒细胞浸润少于AF+DMSO组(图1E～J)。MPO实验结果显示,经过AU处理后小鼠角膜中性粒细胞活性小于AF+DMSO组,差异有统计学意义(t=9.882,P<0.001)。见表3。

A、B分别为AF+DMSO组与AF+AU组小鼠感染第1天的裂隙灯拍照图像;C、D分别为AF+DMSO组与AF+AU组小鼠感染第3天的裂隙灯拍照图像;E～G为AF+DMSO组小鼠感染第3天中性粒细胞免疫荧光染色图片(400倍);H～J为AF+AU组小鼠感染第3天中性粒细胞免疫荧光染色图片(400倍)。绿色图像(E、H)为使用NIMP-R14-FITC标记的中性粒细胞,蓝色图像(F、I)为使用DAPI标记的细胞核,Merge(G、J)指示中性粒细胞在角膜组织中的定位。

表3 AU处理对临床评分和MPO活性影响

2.3 AU对小鼠AF角膜炎中炎症相关因子IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响

析因设计方差分析显示,AU处理、AF处理、AU与AF处理的交互作用对IL-1β和IL-6的mRNA表达均有影响(FAU=23.154、34.673,FAF=41.883、82.697,FAU×AF=23.173、34.942,P均<0.001)。单独效应分析显示,不用AF处理时,AU处理与不处理的小鼠炎症因子IL-1β和IL-6的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);不用AU处理时,AF处理与不处理相比IL-1β和IL-6mRNA表达上升,差异有统计学意义(F=57.595、128.336,P<0.001);用AF处理时,感染第3天时AU处理与不处理相比小鼠角膜IL-1β和IL-6的mRNA表达明显下降,差异有显著性(F=59.356、110.224,P<0.001);用AU处理时,AF处理与不处理相比小鼠IL-1βmRNA表达水平差异有统计学意义(F=4.511,P<0.05),IL-6mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组小鼠IL-1β、IL-6 mRNA表达比较

析因设计方差分析显示,FAU=23.154、34.673,FAF=41.883、82.697,FAU×AF=23.173、34.942,P<0.001。与DMSO组比较,*F=57.595、128.336,P<0.001;与AF+DMSO组比较,#F=59.356、110.224,P<0.001;与AU组比较,&F=4.511,P<0.05。

2.4 AU对HCECs中AF诱导的炎症的影响

析因设计方差分析显示,AU处理、AF处理、AU与AF处理的交互作用对Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6的mRNA表达均有影响(FAU=9.111～60.965,FAF=84.676～673.934,FAU×AF=9.295～47.024,P<0.01)。单独效应分析显示,不用AF处理时,AU处理与不处理Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6mRNA差异无统计学意义(P>0.05);不用AU处理时,AF处理与不处理相比上述受体和炎症因子的mRNA表达明显上升,差异有统计学意义(F=19.877～538.499,P<0.001);用AF处理时,AU处理与不处理相比Nrf2、HO-1mRNA表达明显上升,IL-1β和IL-6的mRNA表达水平明显下降(F=17.569～103.117,P<0.001);用AU处理时,AF处理与不处理相比Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平差异均有统计学意义(F=71.630～431.986,P<0.001)。见表5。

表5 各组HCECs受体和相关炎症因子的mRNA表达比较

析因设计方差分析显示,AU处理、AF处理、AU与AF处理的交互作用对Nrf2、HO-1和IL-6蛋白表达均有影响(FAU=61.030～95.257,FAF=106.921～663.812,FAU×AF=48.953～69.333,P<0.01)。单独效应分析显示,不用AF处理时,AU处理与不处理相比Nrf2、HO-1和IL-6蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);不用AU处理时, AF处理与不处理相比上述受体和炎症因子蛋白表达上升,差异有统计学意义(F=69.637～169.483,P<0.001);用AF处理时,AU处理与不处理相比,AU处理上调了Nrf2、HO-1蛋白表达,下调了IL-6蛋白表达,差异有统计学意义(F=109.650～146.436,P<0.001);用AU处理时,AF处理与不处理相比Nrf2、HO-1、IL-6蛋白表达差异有统计学意义(F=5.590～548.402,P<0.05)。见表6。

表6 各组HCECs受体和相关炎症因子蛋白表达比较

3 讨 论

真菌性角膜炎是一种具有高致盲率的严重角膜感染性疾病[14]。宿主炎症反应是角膜病变破坏的重要原因之一[15]。过度免疫反应会导致角膜混浊,甚至发生角膜穿孔威胁视力[3]。AU是一种来源于传统草药的环烯醚萜苷,是一种具有丰富潜在来源、良好安全性和众多有益生物活性的化合物,具有很高的潜在应用价值。

本研究结果显示,经过AU处理的感染第3天小鼠角膜溃疡面积减小,角膜透明度提高,临床评分降低,提示AU对真菌性角膜炎起到保护作用。炎症细胞尤其是中性粒细胞浸润角膜是角膜炎结局的主要决定因素[16]。MPO是一种含阳离子血红素的酶,存在于中性粒细胞中,炎症激活的中性粒细胞诱导炎症因子和MPO的释放,进一步引起炎症部位组织损伤,从而导致严重的视力损害[17-18]。既往研究表明,中性粒细胞增多会导致铜绿假单胞菌角膜炎不可逆的角膜组织破坏[19]。本研究结果显示,AU显著减轻了AF角膜炎中性粒细胞浸润程度,抑制了MPO的活性。既往研究显示,AU能够使LPS诱导的急性肺损伤的肺组织病理损伤评分和中性粒细胞数量显著降低,从而减轻炎症反应[20]。本文研究结果与其一致。推断AU通过抑制中性粒细胞募集从而在AF角膜炎中发挥抗炎作用。

本文研究还探究了AU对AF诱导的小鼠角膜和HCECs炎症中炎症因子表达的影响。白细胞介素-1家族(IL-1家族)的细胞因子和受体在炎症中的作用是众所周知的。其中IL-1β的产生与疾病严重程度相关,其在自身免疫性和慢性炎症中发挥作用[21]。IL-6是先天免疫的关键细胞因子,其具有与宿主防御、免疫细胞调节、增殖和分化相关的广泛的生理功能[22]。本文研究结果显示,AF刺激能够使HCECs和小鼠角膜中的IL-1β、IL-6等炎症因子的表达上升,而AU能够下调这些炎症因子表达。有研究结果显示,AU能够降低LPS诱导的牛子宫内膜上皮细胞炎症中IL-1β、IL-6的表达[23]。本文研究结果与其相一致。真菌细胞壁的主要组成部分葡聚糖是宿主细胞识别的主要病原相关分子模式[24]。研究表明,真菌β-葡聚糖通过Nrf2途径诱导口腔角质细胞中HO-1的表达,在宿主防御口腔上皮念珠菌感染引起的应激方面发挥重要作用[25]。另有研究结果表明,在高葡萄糖诱导的糖尿病视网膜病变的细胞模型中,Nrf2/HO-1通路的激活可以保护人视网膜上皮细胞免受高葡萄糖诱导的炎症损伤[26]。Nrf2和HO-1的激活能够下调炎症因子水平,从而抑制真菌性角膜炎的炎症反应。本文研究结果显示,AU能够显著上调AF诱导的HCECs中Nrf2和HO-1的表达,提示AU可能通过Nrf2/HO-1通路下调炎症因子的表达,从而在AF诱导的炎症中发挥抗炎作用。

综上所述,AU能够抑制中性粒细胞募集,减轻AF角膜炎小鼠病情严重程度,下调体内外炎症因子IL-1β、IL-6的表达水平,并且AU预处理能够激活模式识别受体Nrf2和HO-1表达,提示AU可能通过Nrf2/HO-1通路在AF诱导的炎症过程中发挥抗炎作用。