拉米夫定替诺福韦片有关物质HPLC方法检测

唐嘉悦　黄德见

摘 要：建立HPLC法检测拉米夫定替诺福韦片有关物质的方法，为拉米夫定替诺福韦片的质量控制提供方法依据。采用BDS C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），以0.025mol/L醋酸铵、乙腈和甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长260nm，进样量5μL。结果显示各色谱峰均能良好分离，各杂质浓度和峰面积线性关系良好，平均回收率在95.0%～105.0%。本方法专属性强、灵敏、准确，可用于拉米夫定替诺福韦片有关物质的测定，同时填补了国内关于拉米夫定替诺福韦片有关物质检测方法的空白。

关键词：拉米夫定替诺福韦片；有关物质；质量控制

中图分类号：R927.11  文獻标识码：A  文章编号：1673-260X（2023）11-0016-04

拉米夫定替诺福韦片为拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯的复方制剂，临床上主要用于乙型肝炎感染治疗和艾滋病治疗[1-4]。为抗人类免疫缺陷病毒（HIV）的一线药物。WHO药物资格预审名单中收录有Hetero、Mylan、Cipla等六家印度公司生产本品，截至2019年国内仅1家公司被批准上市。

关于拉米夫定替诺福韦片有关物质的测定方法，国内外未见文献报道。为了严格控制其质量，本文采用HPLC法对拉米夫定替诺福韦片有关物质进行了研究，结合拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯的合成工艺，分析其杂质谱[5-8]，其结构式见图1。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司产；BT25S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产。

1.2 试药及试剂

对照品：富马酸替诺福韦二吡呋酯（GOM335，USP，99.3%）、拉米夫定（210405，自制，99.5%）、拉米夫定分离度混合物C（USP，FOK348）、杂质对照品A（210305，自制，98.5%）、杂质对照品B（210305，自制，99.5%）、杂质对照品C（210305，自制，97.5%）、杂质对照品D（210305，自制，98.4%）、杂质对照品E（210306，自制，98.5%）、杂质对照品F（210205，自制，99.2%）、杂质对照品G（210305，自制，95.5%）、杂质对照品H（210305，自制，96.7%）、杂质对照品I（210305，自制，98.5%）、杂质对照品J（210315，自制，98.5%）杂质对照品K（210325，自制，96.5%）杂质对照品L（210308，自制，97.5%）杂质对照品M（210205，自制，99.5%）。

试剂：乙腈（色谱纯）、水（超纯水）、醋酸铵（分析纯）、冰醋酸（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：BDS C18柱，4.6×250mm，5μm；检测波长260nm；柱温35℃；流速1.0mL/min；进样温度6℃；进样量5μL。

流动相：按表1进行线性梯度洗脱；

流动相A－0.025mol/L醋酸铵（用冰醋酸调节pH值至3.9±0.1）：甲醇（95：5）

流动相B－0.025mol/L醋酸铵（用冰醋酸调节pH值至3.9±0.1）：乙腈（40：60）

流动相C－0.025mol/L醋酸铵（用冰醋酸调节pH值至3.9±0.1）：乙腈（20：80）

2.2 溶液配制

（1）系统适用性溶液的配制。取拉米夫定分离度混合物C对照品1支，加入乙腈：水（10：90）混合溶剂2.5mL使溶解，摇匀，作为系统适用性溶液（1）。

取拉米夫定，富马酸替诺福韦二吡呋酯和杂质G、H、I、J、K、L、M各适量，加入流动相A溶解稀释定容后配制成含拉米夫定3mg/mL、富马酸替诺福韦二吡呋酯3mg/mL，杂质I 100μg/mL其他杂质10μg/mL的混合溶液，作为系统适用性溶液（2）。

（2）供试品溶液的配制。精密称取本品细粉适量（约相对于富马酸替诺福韦二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加流动相A适量超声5分钟，并稀释至刻度，摇匀，用0.45？滋m的滤膜滤过。

（3）对照溶液的配制。精密量取供试品溶液1mL，置200mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性

取系统适用性溶液（1）（2）各5？滋L按上述色谱条件连续进样5次，结果见图2。结果显示，各色谱峰之间分离度均大于1.5。重复进样结果显示各组分系统参数的RSD%均≤5.0%；结果均符合要求。

2.3.2 专属性实验

精密量取流动相A 5μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪，按处方比例取混合辅料按供试品溶液制备方法制成溶液，照上述色谱条件测定，结果空白溶剂空白辅料均不干扰样品检测。结果见图3。

（1）酸破坏试验：精密称取本品的细粉适量（约相当于富马酸替诺福韦二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加6mol/L盐酸溶液2ml，摇匀，放置10分钟，中和，加流动相A适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过。

（2）碱破坏试验：精密称取本品的细粉适量（约相当于富马酸替诺福韦二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液2mL，摇匀，放置10分钟，中和，加流动相A适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过。

（3）高温破坏试验：精密称取置100℃加热6h样品细粉适量（约相当于富马酸替诺福韦二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加流动相A适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过。

（4）氧化破坏试验：精密称取本品的细粉适量（约相当于富马酸替诺福韦二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加30%过氧化氢溶液2mL，摇匀，放置10分钟，加流动相A适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过。

（5）光照破坏试验：精密称取已置太阳光下照射15天的本品细粉适量（约相当于富马酸替诺福韦二吡呋酯30mg），置10mL量瓶中，加流动相A适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过。

按上述色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，主峰与相邻杂质及各降解杂质峰分离度符合要求，结果见表2。

2.4 检测限、定量限

将上述杂质用流动相不断稀释，精密量取检测限、定量限溶液各5μL按2.1项下色谱条件注入液相色谱仪，当信噪比S/N≥10时，即为定量浓度及定量限，当信噪比S/N≥3时，即为检测浓度及检测限。结果杂质A的定量限浓度为0.1679μg/mL，检测限浓度为0.0569μg/mL；杂质B的定量限浓度为0.1532μg/mL，检测限浓度为0.0528μg/mL；杂质C的定量限浓度为0.2000？g/mL，检测限浓度为0.1000μg/mL；杂质D的定量限浓度为0.2000μg/mL，检测限浓度为0.1000μg/mL；杂质E的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0785μg/mL；杂质F的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0750μg/mL；杂质G的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0700μg/mL；杂质H的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0785μg/mL；杂质I的定量限浓度为0.2500μg/mL，检测限浓度为0.0569μg/mL；杂质J的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0785μg/mL；杂质L的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0785μg/mL；杂质M的定量限浓度为0.1500μg/mL，检测限浓度为0.0785μg/mL；拉米夫定的定量限浓度为0.1750μg /mL，检测限浓度为0.0890μg/mL；富马酸替诺福韦二吡呋酯的定量限浓度为0.1750μg/mL，检测限浓度为0.0875μg/mL。

2.5 线性

取上述杂质对照品各适量，精密称定，加流动相A使溶解，再加稀释剂逐步稀释制成适宜浓度的系列标准溶液。精密量取系列标准溶液各5μL，按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录峰面积。以C（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，做回归方程。结果杂质A的回归方程为A=9.7014C-0.314 r=1；杂质B的回归方程为A=56.5977C+0.2359 r=0.9999；杂质C的回归方程为A=56.5977C+0.2359 r=0.9999；杂质D的回归方程为A=8.9358C-0.7073 r=1；杂质E的回归方程为A=7.1591C-1.602 r=1；杂质F的回归方程为A=14.029C+1.0604 r=0.9998；拉米夫定的回归方程为A=9.7727C+8.7101 r=0.9999；富马酸替诺福韦二吡呋酯的回归方程为A=6.0942C+39.024 r=0.9998；杂质G的回归方程为A=6.2244C+8.1014 r=1；杂质H的回歸方程为A=28.288C-0.7321 r=0.9998；杂质I的回归方程为A=16.953C-2.2805 r=1；杂质J的回归方程为A=10.352C+1.42263 r=0.9999；杂质K的回归方程为A=8.7401C-2.6152 r=1；杂质L的回归方程为A=14.703C-1.165 r=0.9997；杂质M的回归方程为A=20.138C-1.2967 r=1，各组分在LOQ～至少150%的限量浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.6 重复性

取同一批号样品适量，共6份，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，结果6次结果显示杂质检出个数、已知杂质检出量、最大单杂和总杂质基本不变；说明本方法具有较好的重复性。

2.7 回收率

取同一批号样品适量，分别置于9个10mL量瓶中，再分别按限度浓度的80%、100%和120%加入上述对照品各3份混匀，按上述供试品溶液的制备方法制成供试品溶液。结果，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的回收率分别为96.5%、103.9%、100.1%、103.6%、102.9%、103.5%、98.5%、99.5%、97.2%、96.5%、98.2%、94.8%、96.5%。RSD%分别为0.30%、0.45%、1.85%、0.42%、1.58%、2.15%、1.24%、1.38%、1.45%、2.10%、1.98%、2.00%、1.87%。

2.8 耐用性

分别考察了醋酸铵的浓度、pH值、流速、柱温以及流动相比例的±10%微小变化对系统适用性（1）（2）及同一批次有关物质供试品溶液检测结果的影响，结果各因素微小变化对系统适用性试验及有关物质检测结果基本无影响。说明本方法耐用性良好。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

富马酸替诺福韦二吡呋酯和拉米夫定最大吸收波长分别为260nm和277nm，由于两者处方量相同，综合各杂质的紫外吸收，对波长260nm和277nm分别进行了专属性考查，结果表明通过酸、碱、氧化、高温、光照强制降解试验主峰与相邻杂质峰之间均能较好分离。考虑到在相同浓度下富马酸替诺福韦二吡呋酯在277nm波长处吸收比拉米夫定弱。因此选择富马酸替诺福韦二吡呋酯最大吸收波长260nm作为检测波长[9-12]。

3.2 流动相及色谱柱的选择

本品为复方制剂，建立有关物质分析方法时应同时考虑拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯相关杂质，由于拉米夫定及其杂质极性大于富马酸替诺福韦二吡呋酯及相关杂质，因此本方法前15分钟主要参考“拉米夫定片”中国药典或BP药典方法用于对拉米夫定及相关杂质的分离。至15分钟后，随着有机相比例增高，富马酸替诺福韦二吡呋酯相关杂质可被完全洗脱出来。最终优化方法色谱条件下，拉米夫定的保留时间约为9分钟，富马酸替诺福韦二吡呋酯的保留时间约为38分钟。各峰之间分离度均较好[13-15]。

4 结论

本实验建立了一种有效检测拉米夫定替诺福韦片有关物质的分析方法，并对其进行了方法学验证。实验结果表明，该方法可简便有效地检测相关杂质，各杂质之间的分离度均大于1.5。系统适用性、专属性、线性、回收率均较好，检测灵敏度高。可用于拉米夫定替诺福韦片有关物质的检测。填补了国内关于该品种有关物质检测方法的空白，为质量标准制定奠定了基础。

参考文献：

〔1〕余史丹，汪硕闻，唐原君，等.替诺福韦、依非韦伦对拉米夫定在大鼠体内药动学的影响[J].中南药学，2022，20（09）：2033-2040.

〔2〕马春涛，霍秀敏，王强.我国艾滋病抗病毒治疗药品注册情况分析[J].中国艾滋性病，2020，26（09）：941-944+953.

〔3〕項少黎，储文龙.替诺福韦联合拉米夫定片和洛匹那韦利托那韦片治疗艾滋病的效果评价[J].中国实用医药，2022，17（05）：163-165.

〔4〕黄婉盈，郭姝悦，张晓丹.替诺福韦酯联合拉米夫定治疗艾滋病合并乙型肝炎病毒感染的临床疗效分[J].航空航天医学杂志，2021，32（09）：1094-1095.

〔5〕徐凤杰，杨永忠.拉米夫定的合成进展[J].云南化工，2009，36（06）：33-35.

〔6〕王华，邹柳，刘映，等.拉米夫定的合成工艺优化[J].临床合理用药杂志，2016，9（34）：88-90.

〔7〕朱卫兵.富马酸替诺福韦二吡呋酯的合成[J].应用化工，2020，49（S2）：360-362.

〔8〕张奇，郭明，赫畅，等.富马酸替诺福韦二吡呋酯的合成工艺[J].沈阳药科大学学报，2018，35（07）：543-546+556.

〔9〕伏瑶，刘松霞，范彩霞，等.伊沙匹隆有关物质的HPLC法检测[J].药物分析杂志，2022，42（10）：1801-1807.

〔10〕刘晓坤，王世潇，方诗源，等.高效液相色谱法同时测定普那布林原料药中9种有关物质[J].中国海洋药物，2023，42（03）：63-68.

〔11〕刘振丽，徐丽.高效液相色谱法测定西咪替丁片中的有关物质和含量[J].黑龙江医药，2022，46（15）：1854-1856.

〔12〕白莉霞，刘希望，杨亚军，等.高效液相色谱法测定阿司匹林丁香酚酯咀嚼片的有关物质[J].中国畜牧医药，2023，50（07）：3007-3016.

〔13〕庞赛，梁爱仙，陈颜清，等.HPLC法测定氨酚曲马多片有关物质方法的建立[J].中国药师，2022， 25（09）：1689-1693.

〔14〕周琳.烟酸片中有关物质的测定及结果分析[J].海峡药学，2022，34（05）：71-74.

〔15〕保敏敏，吕蓓蓓，魏文芝，等.奥卡西平片中有关物质含量测定方法的建立[J].中国药房，2023，34（10）：1199-1203.