牙龈卟啉单胞菌感染及维生素D通路蛋白表达对食管鳞癌患者生存预后的影响

钱梦凡,孔金玉,刘怡文,孙 蔚,周福有,高社干

食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发病机制尚未明确,病死率极高[1]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)感染已被证实为ESCC患者预后不良的主要高危因素[2]。资料显示,维生素D(vitamin D,VitD)是人体必需的脂溶性维生素,不仅可促进生长和骨骼钙化,还可降低病原微生物载量,诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抑癌作用[3-4]。其中,VitD 24-羟化酶(vitamin D 24-hydroxylase,CYP24A1)、VitD 1α-羟化酶(vitamin D 1α-hydroxylase,CYP27B1)及VitD受体(vitamin D receptor,VDR)为VitD代谢通路中的关键调控因子,三者活性的改变参与肿瘤发生发展[5],且CYP24A1和VDR的基因多态性与ESCC显著相关[6]。基于VitD代谢受阻与ESCC的发病密切相关[6]及病原微生物可通过干扰VitD代谢促进肿瘤恶性发展[7],推测Pg感染及VitD代谢通路关键调控因子表达改变可能与ESCC患者预后密切相关。

该研究旨在通过检测ESCC患者组织中Pg感染情况及CYP24A1、CYP27B1与VDR表达情况,分析各指标对患者生存预后的影响,以期为ESCC患者临床防治策略的制定提供可靠指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂与仪器 Pg抗体(意大利Diatheva公司,货号:ANT0085),CYP24A1(武汉Proteintech公司,货号:25174-1-AP)、CYP27B1及VDR抗体(英国Abcam公司,货号:ab206655、ab3508);二步法免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:PV-9000);柠檬酸钠抗原修复液、DAB显色试剂盒及PBS(北京Solarbio公司,货号:C1032、DA1010、P1010);苏木精(南京建成生物工程研究所,货号:I030-1-1);中性树胶(上海Sangon Biotech公司,货号:E675007-0100)。组织切片扫描仪(匈牙利3DHIESTECH公司,型号:Pannoramic MIDI),光学显微镜(日本 Nikon公司,型号:ECLIPSE Ni-E)。

1.1.2病例资料 选择安阳市肿瘤医院2015年1月—2017年1月行ESCC根治术的185例ESCC患者为研究对象。收集手术切除的ESCC组织石蜡包埋样本进行常规切片,切片厚度为3 μm,用于后续指标检测。本研究于术前获得患者知情同意,并且通过安阳市肿瘤医院伦理委员会审核批准(伦理批号:2023WZ16K01)。入组标准及排除标准见图1,最终纳入173例ESCC患者。患者随访期为60个月,生存时间为确诊时间至死亡或确诊后60个月。

图1 本研究ESCC患者入组标准

1.2 方法IHC染色根据IHC试剂盒及DAB显色试剂盒说明书步骤进行IHC染色。采用Pg、CYP24A1、CYP27B1与VDR抗体按说明书推荐浓度进行抗体孵育。结果判读:① 染色强度评分:无着色、浅黄色、棕黄色及棕褐色分别为0、1、2、3分;② 阳性细胞百分比评分:≤5%、>5%且≤25%、>25%且≤50%、>50%且≤75%及>75%分别为0、1、2、3、4分。①与②乘积为最终IHC评分。于400倍光学显微镜下判读各指标染色结果,随机拍摄5个视野并计算IHC评分的平均值。本研究中,各指标判定标准为:<2分为阴性,≥2分为阳性[2,8-9]。

1.3 统计学处理运用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用χ2检验分析Pg感染情况及CYP24A1、CYP27B1与VDR表达情况之间相关性以及各指标与患者临床病理特征之间相关性。用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并用Log-rank检验生存曲线之间的差异。单因素Cox回归计算风险比例(hazard ratios,HR)及其95%置信区间。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC组织中Pg、CYP24A1、CYP27B1与VDR的表达情况采用IHC检测173例ESCC组织中Pg感染情况及CYP24A1、CYP27B1与VDR表达情况。结果如图2所示,ESCC细胞胞浆出现棕黄色颗粒代表上述各指标阳性,Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR的阳性率分别为43.35%、37.57%、20.23%及21.97%。Pg感染与CYP24A1、CYP27B1及VDR相关(均P<0.05)。见表1。

表1 ESCC组织中各指标之间的关系[n(%)]

图2 ESCC组织中Pg、CYP24A1、CYP27B1

2.2 Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR与ESCC患者临床病理特征之间的关系采用χ2检验分析各指标与ESCC患者临床病理特征之间的关系。结果如表2所示,在男性、有吸烟史、有饮酒史、肿瘤分化程度为低分化、浸润深度侵及纤维膜、有淋巴结转移及TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期的患者中,Pg感染率及CYP24A1阳性率更高(均P<0.01)。在肿瘤浸润深度未侵及纤维膜、无淋巴结转移及TNM分期为Ⅰ/Ⅱ期的患者中,CYP27B1及VDR阳性率更高(均P<0.01)。

表2 Pg、CYP24A1、CYP27B1及VDR与ESCC患者临床病理特征之间的关系[n(%)]

2.3 Pg、CYP24A1、CYP27B1和VDR对ESCC患者生存预后的影响生存分析结果显示,Pg及CYP24A1阳性组患者生存率低于阴性组患者(均P<0.05),CYP27B1及VDR阴性组患者生存率低于阳性组患者(均P<0.05)。将IHC结果里4张连续切片同时满足Pg感染与CYP24A1表达阳性、CYP27B1与VDR表达阴性的患者归为Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高风险组(共62例),不满足上述条件的归为低风险组(共111例)。结果显示:高风险组患者生存率低于低风险组患者(均P<0.05)。此外,Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高风险组患者预后最差,死亡风险最高(HR=4.59, 95%CI: 3.04～6.71)。见图3、表3。

图3 各组ESCC患者术后5年生存曲线

2.4 Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高低风险组对不同ESCC人群生存预后的影响以患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史及TNM分期为分层变量,分析不同ESCC人群中Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高低风险组患者生存时间之间差异,结果如图4、表4所示,在各分层标准的ESCC人群中,高风险组患者死亡风险均较高,预后均较差(均P<0.05);尤其是在TNM分期为Ⅰ/Ⅱ期的ESCC人群中,与低风险组相比,高风险组患者的死亡风险增加更为明显(HR=19.83, 95%CI: 5.70～68.98,P<0.05)。

表4 各临床病理特征高风险组与低风险组ESCC患者的生存曲线比较

图4 各组ESCC患者术后5年生存曲线

3 讨论

VitD为免疫调节剂,在机体的抗感染免疫中发挥重要作用。VitD不仅可以促进巨噬细胞和单核细胞产生防御素和抗菌肽,增强其抗菌活性,还可与免疫细胞上的VDR结合,刺激免疫细胞增殖分化,调节固有免疫和适应性免疫,参与清除病原微生物、减轻组织损伤[10]。VitD能降低乙肝病毒及幽门螺杆菌等病原微生物载量,抑制肝癌及胃癌的恶性演进[3-4],还能抑制病原微生物毒力因子(如黏附素、蛋白酶等)活性,削弱其致病力[11]。乙肝病毒可通过下调VDR表达,阻止活性VitD发挥作用,降低机体免疫防御功能,协助自身大量复制,促进肝癌细胞的恶性增殖[7]。

VitD代谢通路中关键调控因子表达量改变可促进多种肿瘤恶性演进[12]。CYP24A1是活性VitD的灭活酶,可灭活1,25-二羟基维生素D3,抑制其发挥功能,在多种肿瘤中的表达量显著高于癌旁正常组织,已被证实为潜在的促癌基因[8,12-14]。CYP27B1是VitD合成的关键限速酶,其表达与肺、前列腺、结肠以及甲状旁腺肿瘤的进展呈负相关,且在多种恶性肿瘤中均可发挥抗癌作用[14]。VDR是VitD发挥功能的主要受体,VitD代谢通路主要依靠二者结合作用于靶细胞发挥效应。在消化系统肿瘤中,VDR表达量降低与发病风险增高有关[12]。Yang et al[6]发现血浆中的VitD水平与ESCC显著相关,且VDR和CYP24A1的基因多态性与ESCC易感性相关。Bao et al[15]发现VDR高表达的ESCC患者生存期显著高于VDR低表达患者,且体外细胞模型发现VDR是ESCC的抑制因子,上调VDR基因表达可抑制ESCC细胞增殖。上述研究与本研究结果一致。但目前ESCC研究中,尚无Pg感染及VitD通路基因之间相关性的报道。本研究发现,ESCC组织中Pg、CYP24A1、CYP27B1及VDR的阳性率分别为43.35%、37.57%、20.23%及21.97%。其中,Pg感染与CYP24A1、CYP27B1及VDR相关,表明Pg感染的ESCC细胞中CYP24A1活性增强,而CYP27B1及VDR活性降低。Pg感染阳性和CYP24A1表达阳性组的患者中,男性、有吸烟史及饮酒史的患者比例增加,提示可能由于大多数男性患者长期吸烟、饮酒,口腔环境差,造成Pg及CYP24A1阳性率均增高。两个指标阳性组患者中,肿瘤分化程度为低分化的患者比例增加,提示恶性程度更高的ESCC微环境更适合Pg定植,定植部位CYP24A1多为高表达。Pg+24A1+27B1-VDR-高风险组,肿瘤浸润深度侵及纤维膜、有淋巴结转移及TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期的患者比例增加。表明Pg感染、VitD代谢通路中CYP24A1阳性率增高及CYP27B1与VDR阳性率降低可加速ESCC恶性进程。

本研究生存分析结果显示,Pg感染与CYP24A1表达阳性组、CYP27B1与VDR表达阴性组患者生存期均缩短,表明Pg感染及VitD代谢通路相关蛋白表达改变与ESCC患者预后不良密切相关;Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-高风险组患者,死亡风险更高,表明同时满足上述指标改变的患者生存预后更差。此外,本研究发现在各分层标准的ESCC人群中,高风险组患者死亡风险均较高,预后均较差,表明Pg+CYP24A1+CYP27B1-VDR-可作为ESCC患者预后预测的可靠指标。