丹黄散激活PINK 1/Parkin信号通路对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的影响

范 燚,张春玲,赵 伟,陈 露,邸铁涛,周世勇,魏良纲,张 艳,董源源

糖尿病溃疡(diabetic ulcers,DUs)作为一种慢性、难愈性疾病,是糖尿病的常见并发症之一。DUs的发病机制复杂,传统治疗方法伤口愈合缓慢、治疗时间长、治疗成本高,给患者带来痛苦[1]。寻找有效可行的干预靶标,成为相关领域的研究热点和难点。血管内皮细胞长期暴露与于高糖环境下,易出现炎症损伤,从而导致血管病变[2]。线粒体自噬通过自噬方式靶向选择性清除功能受损的线粒体,从而维持线粒体功能网络动态平衡。研究[3]表明,线粒体自噬水平降低,且与其它机制的交互作用是DUs难愈合的关键原因之一。磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)诱导假定激酶(PTEN induced putative kinase,PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路通过调控自噬可识别并清除受损的线粒体,是目前较公认的自噬途径,被广泛用来评估自噬水平[4]。丹黄散是由丹参、大黄、当归、没药、沉香、松香几味药物组成的复方散剂,具有活血化瘀、祛腐生肌、利湿解毒之功效。前期研究[5]显示,丹黄散具有促进糖尿病大鼠溃疡愈合的效果,可促进创面肉芽组织生长,然而其作用机制尚未明确。该研究以PINK 1/Parkin通路介导的线粒体自噬为靶向,探究丹黄散对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的影响,并探讨其是否能通过Pink1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬,维持创面细胞线粒体正常结构与功能,促进DUs创面愈合。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞 人脐静脉血管内皮细胞(货号:DFSC-EC-01)购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2实验药物 丹黄散为贵州中医药大学第二附属医院院内制剂(黔药制字Z 03 100 240)。方中药物大黄、丹参、当归、沉香、松香、没药均由院内药剂科按照2020年版《中国药典》标准进行采购,按照比例混合经30 B粉碎机物理粉碎后充分混匀,取得的中药粉末以能过120目筛为宜,用60 Co-γ辐照灭菌处理,用无菌水调和。重组人表皮生长因子凝胶(以下简称生长因子),国药准字S 20020123,购自桂林华诺威基因药业有限责任公司,规格为10 g/支。

1.1.3主要试剂和仪器 葡萄糖(货号:H 42021168)购自湖北科伦药业有限公司;山羊血清封闭液(货号:SL 038)购自北京Solarbio公司;胎牛血清(货号:12483020)购自美国Gibco-BRL公司;Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(货号:ZF-0511)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号:ZB-2301)、荧光封片剂(含DAPI)(货号:ZLI-9557)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Anti-PINK 1抗体(货号:DF 7742),Anti-LC 3-Ⅱ(货号:AF 4650),购自美国Affinity公司;Anti-Parkin抗体(货号:66674-1-Ig)、Anti-Bcl2抗体(货号:68103-1-Ig)、anti-Beclin1抗体(货号:11306-1-Ap)、Anti-Bax抗体(货号:60267-1-Ig)、β-actin(货号:81115-1-RR)均购自武汉三鹰公司;BCA 蛋白定量试剂盒(货号:33267)购自珠海贝索生物技术有限公司;Transwell上小室(货号:3422)购自美国康宁公司;结晶紫(货号:C196471)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;30 B粉碎机(型号:GMP30B)购自常州市久川干燥设备有限公司;显微镜(型号:BX53)、倒置荧光显微镜(型号:IX51)均购自日本OlymPus公司;移液枪购自德国EPPendorf公司;免疫组化笔(型号:ZLI-9305)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;二氧化碳细胞培养箱(型号:HF90)购自上海力申科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及分组 将人脐静脉血管内皮细胞在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养,每2～3 d传代1次,使用第3代细胞展开实验。探索丹黄散对血管内皮细胞作用效果。将实验分组为:对照组、生长因子组、丹黄散组、高糖组、高糖+生长因子组、高糖+丹黄散组,每组3 例。对照组加入10%空白血清,在对照组基础上,生长因子组加入生长因子,丹黄散组加入10%丹黄散,高糖组加入30 mmol/L葡萄糖,高糖+生长因子组加入30 mmol/L葡萄糖和生长因子,高糖+丹黄散组加入30 mmol/L葡萄糖和10%丹黄散。

1.2.2细胞划痕实验检测细胞转移率 将6 组细胞分别置于6孔板中,培养24 h,待细胞融合到90%后,用移液枪垂直于细胞培养盘底部缓慢划痕;PBS清洗3次,在细胞培养箱中继续培养,在倒置荧光显微镜下分别于0、48 h观察并记录划痕距离,计算细胞转移率。细胞转移率=(0 h划痕距离-48 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%。

1.2.3Transwell实验检测细胞侵袭 取6 组细胞悬液接种到铺有基质胶的Transwell上室,放入培养箱中继续培养48 h,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色10 min,PBS清洗3次,倒置显微镜下随机选取5个视野,记录侵袭细胞数。细胞侵袭率=侵袭细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4免疫荧光试验检测抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的蛋白表达情况 取6 组细胞进行爬片,PBS浸洗、室温、封闭后,加入3% BSA稀释的一抗Anti-Bcl-2(1 ∶100)、anti-Beclin1(1 ∶100)、Anti-Bax(1 ∶100),4 ℃湿盒内孵育过夜,PBS浸洗3次,滴加稀释好的荧光二抗(Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG,1 ∶100),37 ℃湿盒孵育1 h,PBS漂洗3 次,DAPI核染5 min,去离子水漂洗,封片,在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5Western blot技术检测PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表达情况 取各组处于对数生长期的细胞,PBS清洗2次,加入细胞裂解液,离心后取上清液,BCA法测定总蛋白浓度,蛋白变性、上样、电泳、转膜,加入一抗Anti-PINK 1(1 ∶1 000)、Anti-Parkin(1 ∶1 000)、Anti-LC 3-Ⅱ(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜,次日复温,加二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG,1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h,TBS洗膜3次,ECL暗室曝光显影。以β-actin为内参,采用ImageJ图像分析软件进行灰度值分析。灰度值=目的条带/β-actin。

2 结果

2.1 6组细胞转移率、侵袭率的情况方差分析发现,6组细胞的转移率、侵袭率差异具有统计学意义(F=31.077、108.281;P<0. 001)。两两比较结果显示,与对照组、生长因子组相比,丹黄散组细胞转移率、侵袭率降低(t=7.708、4.396、25.118、9.320;均P<0. 05);与高糖组、高糖+生长因子组相比,高糖+丹黄散组细胞转移率、侵袭率降低(t=9.120、3.828、11.678、8.374;均P<0. 05)。见表1、图1。说明丹黄散降低能够降低高糖诱导细胞的细胞转移率、侵袭率。

图1 6组细胞增殖的划痕距离和侵袭能力的比较

表1 6组细胞增殖转移率、侵袭率的比较

2.2 6组细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Beclin-1、促凋亡蛋白Bax的蛋白表达情况方差分析显示,6组细胞的Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白表达差异具有统计学意义(F=17.564、19.956、40.108,均P<0. 05)。两两比较结果显示,与对照组、生长因子组相比,丹黄散组Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平升高(t=-6.161、-6.095、-5.804、-3.885;P<0.05), Bax的蛋白水平降低(t=10.823、5.473;P<0.05)。与高糖处理后的高糖组、高糖+生长因子组相比,高糖+丹黄散组细胞Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平仍升高(t=-6.722、-3.330、-7.195、-3.921;P<0.05), Bax的蛋白水平仍降低(t=8.125、7.899;P<0.05)。见表2、图2。说明丹黄散可上调Bcl-2和Beclin-1的蛋白水平,下调Bax的蛋白水平。

图2 6组细胞Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白表达的免疫荧光图 ×200

表2 免疫荧光试验检测6 组细胞Bcl-2、Beclin-1、Bax蛋白的表达水平

2.3 Western blot检测6组细胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表达情况方差分析发现,6组细胞的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表达差异具有统计学意义(F=128.504、101.518、66.948,均P<0. 001)。两两比较结果显示,与对照组、生长因子组相比,丹黄散组的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表达明显增高(t=-14.717、-9.682、-12.135、-11.502、-11.501、-5.765;均P<0.05);与高糖组、高糖+生长因子组相比,高糖+丹黄散组细胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表达仍升高(t=-22.045、-6.197、-12.244、-7.521、-10.954、-6.245;均P<0. 05)。见表3、图3。说明丹黄散可明显提升高糖处理细胞的PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白表达水平。

图3 Western blot检测6组细胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白的表达水平

表3 Western blot检测6 组细胞PINK 1、Parkin、LC 3-Ⅱ蛋白的表达水平

3 讨论

DUs与周围血管损伤密切相关,研究[6]发现,DUs的难愈性与肉芽组织的微血管再生能力降低以及血管生成不良导致的营养供应减少密切相关,促进创面局部血管生成能够在一定程度上改善糖尿病溃疡的愈合障碍。长期高血糖水平和内皮细胞功能障碍是造成周围血管损伤和血管新生困难导致的DUs创面愈合困难的重要原因[7]。因此,在严格控制血糖的同时对血管内皮细胞进行有效保护是预防和治疗DUs的关键。研究[8]发现,高糖会加重细胞氧化应激反应,增加细胞迁移能力和局部侵袭能力。有效抑制高糖状态下的细胞迁移对于阻止疾病进展至关重要。

线粒体自噬对维护细胞内环境稳定起着重要作用,是细胞内一种适应性保护机制,激活血管内皮细胞内线粒体自噬水平可降低细胞凋亡,促进其分化、增殖和迁移[9]。磷酸酯酶与PTEN诱导PINK1/Parkin信号通路是调控线粒体自噬的重要途径,Parkin是一种E3泛素连接酶,能够调控蛋白降解及信号转导,促进自噬体吞噬线粒体,PINK 1具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,作为线粒体膜电位变化感受器,在生理状态下,PINK 1导入线粒体基质被泛素蛋白酶体系统降解,并与Parkin相互作用抑制其向线粒体的转运,维持自噬正常水平[10]。Xi et al[11]研究发现,黄芩素可通过上调 PINK 1/Parkin信号通路调节线粒体自噬,有效保护高糖损伤的血管内皮细胞;上调糖尿病小鼠血管壁PINK 1和Parkin蛋白可诱导线粒体自噬,保护线粒体完整性,减缓血管内皮损伤。由此可见,PINK 1可以通过PINK 1/Parkin信号通路保护血管内皮细胞。PINK 1充当线粒体自噬的“监测者”触发线粒体自噬的起始信号,Parkin作为线粒体自噬信号的“增强子”介导底物泛素化,与Beclin-1和微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC 3-Ⅱ)结合后形成自噬小体,降解受损线粒体。细胞凋亡途径主要依赖线粒体并受线粒体蛋白(Bcl-2家族蛋白)的调节,细胞凋亡时会伴随Bax结合线粒体复合物,抗凋亡蛋白Bcl-2可有效抑制线粒体上的促凋亡蛋白复合体形成[12]。

“祛腐生肌”是难愈性创面的主要治疗方法之一,丹黄散秉承“祛腐生肌”理念,集祛腐与生肌作用于一体。研究[13]表明丹黄散能够促进糖尿病大鼠溃疡创面毛细血管新生,加速伤口愈合。本研究发现丹黄散对高糖诱导的血管内皮具有一定保护作用,可降低细胞侵袭与转移,并激活PINK 1/Parkin信号通路,上调Beclin-1、LC 3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表达,下调Bax的表达,提高线粒体自噬水平。本研究选择的信号通路有大量的上游和下游调控因子,未来工作中可以进行更深层次的研究。