穿心莲内酯调控铁死亡中SLC7A11/GPX4轴减轻脓毒症肠损伤

黄 铭,张艺馨,曹国栋,曾佑成,林 靓,王晓悦,程青虹,3

脓毒症是机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]。在脓毒症发展过程中,肠道是容易受损的器官之一。铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化物累积诱发的细胞死亡方式,经研究证明可通过抑制铁死亡保护脓毒症心脏功能[2],然而铁死亡对于脓毒症肠损伤的作用少有研究。穿心莲内酯(andrographolide,AG)化学式为C20H30O5,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[3]。而AG通过铁死亡对肠损伤发挥的作用尚未可知。本实验通过盲肠结扎穿刺(cecum ligation and puncture,CLP)术构建脓毒症模型,探讨穿心莲内酯能否通过激活铁死亡中溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)轴减轻脓毒症肠损伤。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂穿心莲内酯(货号:365645)及铁死亡抑制剂(ferrostatin-1, Fer-1,货号:347174)购自美国Sigma公司,肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)试剂盒(货号:GMP-TL662、GMP-TL652)购自上海语纯生物科技公司;肠脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)、D-乳酸(货号:SEKM-0239、BC5350)购自北京索莱宝生物技术有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)测定试剂盒(货号:A003-1-2、A006-2-1)购自南京建成生物工程研究所;铁离子比色法检测试剂盒(货号:E1042)购自北京普利莱生物公司;BCA蛋白含量检测试剂盒(货号:P0012S)购自江苏碧云天生物科技有限公司;兔抗溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁重链蛋白1(ferritin heavy chain 1,FTH-1)(货号:T57046、T56969)购自上海Abmart公司,FTH-1抗体(货号:ab183781)购自上海Abcam公司,β-actin抗体、山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(货号:GB110010、GB23301、GB23303)购自武汉赛维尔生物技术有限公司。

1.2 主要仪器Z323K低温离心机(德国HERMILE公司),Elx-800多功能酶标仪(美国Bio-Bad公司),EG1150石蜡包埋机、RM2265轮转式切片机(德国LEICA公司),CH20光学显微镜(日本olympus公司),Tanon-5200 Multi全自动化学发光成像仪(上海天能公司)。

1.3 方法

1.3.1动物分组及模型制备 SPF级雄性SD大鼠80只,体质量(200±25)g,购自新疆医科大学动物实验中心,生产许可证编号:SYXK(新)2011-010101,于SPF级动物房由专人予以鼠饲料及水,室内保持通风,相对温度保持20～25 ℃,相对湿度保持50%～70%,自由进食饮水。本实验已获得石河子大学医学院第一附属医院动物实验伦理委员会批准(编号:A2022-173-01)。将40只SD雄性大鼠随机分为5组,分别是假手术(sham)组、CLP组、AG低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg)[4-5],每组8只;以AG高剂量(AG20)组为最佳剂量组再将其余40只SD雄性大鼠分为sham组、CLP组、AG20组、铁死亡抑制剂(Fer-1)组[6]、AG20+Fer-1组,每组8只。造模开始前1 h,给药组予以AG(20 mg/kg)及Fer-1(10 mg/kg)腹腔注射处理,假手术组予以等体积生理盐水注射。除假手术组外,其余各组均采用CLP建立脓毒症模型[7],具体操作:术前12 h禁食不禁水,予以戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉,消毒后沿大鼠腹中线切开,找到盲肠拉出腹腔,盲肠根部1/4处结扎,穿刺盲肠末端2次,挤出少量肠内容物,回纳盲肠,逐层关腹。假手术组使用相同的操作,不进行结扎及穿孔。术后2 h观察呼吸频率、心率、饮食、活动变化等判断脓毒症模型是否建立成功。

1.3.2炎症及肠黏膜通透性检测 术后24 h取sham组、CLP组、AG低、中、高剂量组腹主动脉血2 ml,离心,取上层血清,按照试剂盒检测血清中炎症水平(IL-6、TNF-α)及肠黏膜通透性水平(I-FABP、D-乳酸)。

1.3.3HE染色 取每组距回盲瓣5 cm处肠组织,4%多聚甲醛溶液中固定后切片、脱蜡、染色、封片,于显微镜下观察肠组织损伤情况。依据Chiu′s分级进行评分,Chiu′s分级[8]具体评分如下:小肠黏膜、绒毛正常(0分);在绒毛顶端中出现肠黏膜上皮下间隙扩大,常伴有毛细血管充血,炎细胞浸润(1分);肠上皮下间隙显著扩张,绒毛顶端上皮抬高与固有层中度分离(2分);固有层大量分离,部分绒毛顶端脱落(3分);绒毛及固有层脱落,毛细血管扩张(4分);固有层消化或破坏,伴出血或溃疡(5分)。

1.3.4透射电镜检测肠组织病理变化 取sham组、CLP组、AG20组、Fer-1组、AG20+Fer-1组大鼠肠组织于电镜固定液固定后经过包埋、脱水、切片及染色后在透射电镜下观察肠组织病理变化。

1.3.5氧化应激水平检测 取sham组、CLP组、AG20组、Fer-1组、AG20+Fer-1组肠组织进行反复研磨后取上清液,参照试剂盒说明书对上清液进行MDA、GSH含量测定。

1.3.6Fe3+检测 取sham组、CLP组、AG20组、Fer-1组、AG20+Fer-1组肠组织进行反复研磨后取上清液,参照试剂盒说明书对上清液进行Fe3+含量测定。

1.3.7Western blot 取sham组、CLP组、AG20组、Fer-1组、AG20+Fer-1组肠组织匀浆上清液蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后,进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,并与SLC7A11、GPX4和β-actin一抗(1 ∶1 000) 4 ℃孵育过夜。第2天,洗膜3次,室温孵育抗鼠或抗兔二抗(1 ∶10 000)1 h,洗膜3次后使用ECL化学发光液显影。采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值,以β-actin为内参,计算目的蛋白相对表达水平。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

2 结果

2.1 AG对脓毒症大鼠炎症指标及肠黏膜通透性的影响如图1,与sham组相比,CLP组血清IL-6、TNF-α、IFBP、D-乳酸水平明显升高(tIL-6=28.70,tTNF-α=37.75,tIFBP=24.06,tD-乳酸=25.28,均P<0.05);与CLP组相比AG 5、10、20 mg/kg组血清IL-6(t5 mg/kg=7.15,t10 mg/kg=11.64,t20 mg/kg=17.42,均P<0.05)、TNF-α(t5 mg/kg=9.09,t10 mg/kg=14.77,t20 mg/kg=21.05,均P<0.05)、IFBP(t5 mg/kg=4.10,t10 mg/kg=8.98,t20 mg/kg=15.89,均P<0.05)、D-乳酸(t5 mg/kg=4.86,t10 mg/kg=10.31,t20 mg/kg=15.43,均P<0.05)水平均逐步降低,呈浓度依赖性(趋势性检验P<0.05)。提示AG可降低炎症及肠黏膜通透性,且高浓度组效果最佳。

图1 AG对脓毒症大鼠IL-6、TNF-α、IFABP、D-乳酸的影响

2.2 AG对脓毒症大鼠肠组织形态学变化的影响如图2所示,sham组肠黏膜绒毛排列整齐,无明显病理学改变;与sham组相比,CLP组绒毛可见断裂及脱落,毛细血管扩张及炎细胞浸润明显,固有层明显破坏,Chiu’s评分降低(t=34.80,P<0.05);与CLP组相比,AG组肠绒毛脱落逐步好转,毛细血管扩张及炎细胞浸润逐步改善,固有层增生和破坏减轻, AG20组改善最为明显(tAG 5 kg/mg=4.85,tAG 10 kg/mg=8.39,tAG 20 kg/mg=13.53,均P<0.05)。

图2 各组大鼠肠组织形态变化及Chiu′s评分 HE ×100

2.3 AG对脓毒症大鼠肠组织绒毛及线粒体变化的影响以AG20组为最佳剂量组进行研究,如图3A所示,在光镜下AG20组和Fer-1组较CLP组相比肠绒毛排列稍整齐,毛细血管扩张减轻,固有层增生及破坏明显好转,Chiu’s评分明显降低(tAG20=11.87,tFer-1=9.33,P<0.05);与AG20组、Fer-1组分别相比,AG20+Fer-1组肠绒毛顶端破坏少,未见明显固有层的增生及破坏,Chiu’s评分降低(t=9.23,t=11.7,P<0.05)。如图3B所示,在电镜下可见sham组肠上皮绒毛结构清晰完整,排列整齐,线粒体无明显改变;CLP组绒毛排列不齐,可见断裂、缺失,线粒体数量减少,空泡样改变严重;AG20组及Fer-1组绒毛排列稍齐,断裂及缺失减少,线粒体空泡稍有改善;而 AG20+Fer-1组肠组织结构破损改善更为明显。

图3 各组大鼠肠组织光镜和透射电镜下形态变化图及Chiu′s评分

2.4 AG对脓毒症大鼠肠组织氧化应激水平的影响以AG20组为最佳剂量组进行研究,如图4所示,与sham组相比,CLP组肠组织中MDA含量明显升高(t=24.57,P<0.05),GSH含量明显降低(t=31.49,P<0.05);与CLP组相比,AG20组及Fer-1组肠组织中MDA含量明显降低(tAG20=9.55,tFer-1=13.21,P<0.05),GSH含量明显升高(tAG20=11.83,tFer-1=13.70,P<0.05);与AG20组、Fer-1组分别相比,AG20+Fer-1组肠组织氧化应激水平下降更为明显(MDA:t=9.87,t=6.21;GSH:t=6.34,t=4.47,均P<0.05)。

图4 不同浓度AG对脓毒症大鼠肠黏膜氧化应激水平的影响

2.5 AG对脓毒症大鼠肠组织Fe3+含量的影响以AG20组为最佳剂量组进行研究,如图5所示,与sham组(4.95±0.78)相比,CLP组肠组织中Fe3+含量(38.86±2.79)明显升高(t=23.81,P<0.05);与CLP组相比,AG20组及Fer-1组肠组织中Fe3+含量(27.53±2.26、23.86±1.51)明显降低(t=7.95,t=10.53,P<0.05);与AG20组、Fer-1组分别相比,AG20+Fer-1组肠组织中Fe3+含量(13.02±2.13)降低更明显(t=10.19,t=7.61,P<0.05)。

图5 不同浓度AG对脓毒症大鼠肠黏膜Fe3+含量的影响

2.6 AG对脓毒症大鼠肠组织SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白表达水平的影响以AG20组为最佳剂量组进行研究,如图6所示,与sham组相比,CLP组肠组织中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量明显降低(tSLC7A11=18.86,tGPX4=38.57,tFTH-1=26.65,P<0.05);与CLP组相比,AG20组(tSLC7A11=3.88,tGPX4=22.89,tFTH-1=4.48)及Fer-1组(tSLC7A11=3.47,tGPX4=24.90,tFTH-1=4.72)肠组织中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量均明显升高;与AG20组、Fer-1组分别相比,AG20+Fer-1组肠组织中SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白含量升高更明显(SLC7A11:t=3.87,t=4.28;GPX4:t=8.21,t=6.19;FTH-1:t=6.10,t=6.34;均P<0.05)。

图6 各组大鼠肠组织SLC7A11、GPX4、FTH-1蛋白表达水平

3 讨论

脓毒症是由免疫紊乱、器官功能失调、炎症风暴等原因诱发多器官功能障碍,肺脏、肾脏、肝脏等器官均可产生病变,从而危及生命[9]。随着研究不断深入,脓毒症并发肠损伤也受到越来越多的关注。肠道微生态失衡、线粒体功能障碍、异常肠道细胞死亡等机制均可诱发脓毒症肠损伤的发生[10]。本研究中脓毒症组大鼠肠黏膜结构破坏,病理学损伤明显,发生严重的炎症反应,肠黏膜通透性明显增加,提示脓毒症发生时伴有肠道损伤。具有抗氧化、抗炎、抗病毒等广泛药理活性的AG对脓毒症肠损伤的影响报道尚少,本研究对于同样实施了CLP术但经过AG给药后,可见肠黏膜病理损伤逐步改善,炎症反应和氧化应激均有所降低,且剂量越高,作用越明显,均揭示AG对脓毒症肠道起保护作用,但AG对于脓毒症肠损伤的保护作用是通过何种方式起效的,尚无人进行探究。

铁死亡为近年来发现的新型细胞死亡方式,被证实参与脓毒症心脏[11]器官损伤。当铁死亡加重时,细胞内铁累积引起毒性脂质过氧化物ROS的升高,氧化应激水平增高,铁重链蛋白(FTH-1)表达减少。本研究中脓毒症组加入分别加入Fer-1及AG后,Fe3+含量降低,FTH-1蛋白表达提高,抗氧化作用增强,且AG和Fer-1共同作用时上述效果更明显,直接证明了铁死亡不仅参与更是促进了脓毒症肠损伤的发生,而AG可通过减轻铁死亡发挥保护作用。

SLC7A11是System Xc-系统发挥功能的主要亚基,此亚基主要作用是将胞外胱氨酸及胞内谷氨酸以1 ∶1比例交换,使胞内有充足的半胱氨酸来合成GSH,GSH可与GPX4协同将胞内脂质氧化物转化为无毒的脂质醇,以减少细胞内脂质氧化物的累积,从而抑制铁死亡的发生发展,减轻组织损伤[12-13]。本研究CLP组中SLC7A11、GPX4表达均受到抑制,肠组织损伤严重,加入AG及Fer-1后SLC7A11、GPX4蛋白表达增加,肠组织损伤得到修复。AG和Fer-1联用时,铁死亡进一步受到抑制,出现了更强大的抗炎症、抗氧化功能,修复肠组织损伤作用,这可能与AG激活铁死亡中SLC7A11/GPX4轴改善脓毒症肠损伤有关。

综上所述,穿心莲内酯可能通过调节SLC7A11/GPX4轴来抑制铁死亡的发生,从而改善脓毒症大鼠肠损伤。但关于穿心莲内酯是否可以通过SLC7A11/GPX4轴的上游及下游调控靶点控制铁死亡诱导脓毒症肠损伤的发生尚有待深究,未来将在后面的研究中进一步探索。