桑色素通过抑制MMP9表达改善慢性阻塞性肺疾病

冷安明,杨 静,张 葵

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种因气流受限导致的慢性呼吸系统疾病,其发病机制尚未完全明确,吸烟或由于有害气体等刺激气道引起的炎性反应和氧化应激等被认为是导致该病的重要原因[1]。治疗COPD最重要的是改善肺功能,目前针对COPD的主要治疗手段包括肺康复训练、抗菌药物、糖皮质激素的使用、吸入支气管扩张剂等,然而一些药物的不良反应限制了COPD的治疗[2]。

桑色素属于黄酮类化合物,化学式为C15H10O7(图1),主要存在于桑叶等植物中,研究[3]表明其具有抗炎、抗氧化等作用。另外也有研究[4-5]显示其在脂多糖诱导的急性肺损伤、脓毒症肺损伤中均发挥保护作用。但是其在COPD中的作用仍有待进一步研究。网络药理学是基于系统生物学的研究方法,融合了复杂网络、统计学等手段,有利于在分子水平探究药物的作用机制、加强药物基因靶点和生物标志物的开发[6]。该研究旨在从网络药理学角度出发,分析桑色素治疗COPD的潜在基因靶点并且利用动物、细胞模型验证桑色素在COPD中的保护作用和潜在机制。

图1 桑色素化学结构图

1 材料与方法

1.1 试剂、材料与仪器20只雄性SPF级SD大鼠购自广东省医学实验动物中心[生产许可证号:SCXK(粤)2022-0002],体质量(200±20)g,周龄6～7周,将大鼠培养于23 ℃±2 ℃的环境中,湿度50%左右,每天光照12 h,自由摄食和饮水;香烟购自英国哈德门公司(每只含1 mg尼古丁、12 mg一氧化碳以及10 mg焦油);桑色素(货号:480-16-0)购自美国Sigma公司;肺炎克雷伯杆菌(货号:LA9000)和PBS溶液(货号:P1022)购自北京索莱宝科技有限公司;TRIzol试剂盒(货号:abs9331)以及Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒(货号:abs50001)购自爱必信(上海)生物科技有限公司;逆转录试剂盒(货号:LM-63826)购自上海联迈生物工程有限公司;SYBR®PreMix Ex TaqTM试剂盒(货号:RR820A)购自日本Takara公司;MMP9(货号:ab228402)、GAPDH(货号:ab181602)以及IgG(货号:ab302644)抗体均购自英国Abcam公司;白细胞介素6(Interleukin-6, IL-6)试剂盒(货号:ml064292)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)试剂盒(货号:ml002859)均购自上海酶联生物科技有限公司;DMEM培养基(货号:PM150210B)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;Lipofectamine 3000试剂盒(货号:L3000-001)购自上海金畔生物科技有限公司;RIPA裂解液(货号:P0013B)、BCA试剂盒(货号:P0012S)以及MTT试剂盒(货号:C00009)购自上海碧云天生物技术有限公司;酶标仪(型号:SpectraMax M5e)购自美谷分子仪器(上海)有限公司;流式细胞仪(型号:CytoFLEX)购自美国贝克曼库尔特公司;动物呼吸机(型号:RSE3020)购自北京贝兰博科技公司;显微镜(型号:DM1000)购自德国徕卡公司。

1.2 方法

1.2.1化学成分与基因靶点的搜集 将桑色素名称导入pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获得成分简化分子线性输入系统(simplified molecular input line entry system, SMILES)号及其化学结构式,将所得到的结构式导入到SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)数据库预测桑色素的基因靶点。

1.2.2“成分-基因靶点”网络分析 准备化合物基因“network”文件和“Type”文件,运用Cytoscape3.8.2软件,导入相关文件,进行网络拓扑学分析,根据Degree值(基因的连接数量)调整基因靶点图形、颜色、透明度和大小,构造“中药成分-基因靶点”网络图。

1.2.3疾病基因靶点的预测 运用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、DisGenet(https://www.disgenet.org)平台获取疾病相关基因靶点,疾病名称取“chronic obstructive pulmonary disease”为关键词搜疾病相关基因靶点。设置对象为“human”,使用“VLOOKUP”函数匹配基因名。

1.2.4共同作用基因靶点的获取 应用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线网站获取桑色素与COPD的交集基因靶点,作为桑色素和COPD的共同作用基因靶点。

1.2.5蛋白质互作用(protein-protein intersection, PPI)网络构建及网络拓扑分析 通过String(https://string-db.org/)平台,导入交集基因,设置对象为(homo sapiens)、取最高置信度0.900,隐藏游离基因节点,得到蛋白互作用关系。结果导入Cytoscape3.8.2软件中,选择“network analyzer”,得到网络拓扑学参数。然后把下载好的TSV文件导入cytoscape3.8.2软件做PPI图。

1.2.6KEGG富集分析 利用生物信息学开源软件 Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)在 R 语言3.6.3内安装运行clusterProfiler、Stringin、DOSE和Pathview程序,对桑色素和COPD的共同作用基因靶点进行生物学过程的KEGG功能进行富集分析,并通过微生信平台进行可视化。

1.2.7分子对接 将拓扑学参数排名靠前的大分子和小分子进行分子对接。蛋白质晶体结构由RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)或者alphafold数据库(https://alphafold.ebi.ac.uk/)获取(PDB编号:SRC-AF_P42574;MMP9-AF_P31749;MMP2-AF_A0A024R6R4)。对接小分子库由TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)通过搜索中药获取并建立。首先,使用AutodockTools 1.5.6对蛋白质晶体结构进行去水、加氢,并进行受体结构准备工作。使用Open Babel及Autodock程序对小分子库进行拆分等准备工作。使用Autodock程序进行对接,最终将结果导入pymol进行对接结果的可视化。

1.2.8COPD动物模型建立 购买20只SD大鼠,周龄6～7周,体质量(200±20)g。将大鼠培养于23 ℃±2 ℃的环境中,湿度50%左右,每天光照12 h,自由摄食和饮水。将20只大鼠随机分为对照(Control)组、COPD组、桑色素Ⅰ(40 mg/kg)组、桑色素Ⅱ(80 mg/kg)组,每组5只。依据香烟烟雾暴露和反复细菌感染的方法构建COPD大鼠模型[7]。大鼠每天2次暴露于充满香烟烟雾[烟雾体积(3 000±500) ml/m3]的自制熏箱中,每周6 d,持续12周,此外每天给予大鼠0.1 ml的肺炎克雷伯杆菌滴鼻,每周5 d,持续8周。桑色组大鼠每天给予不同浓度的桑色素灌胃直至建模结束。12周后行戊巴比妥钠麻醉大鼠,检查大鼠呼吸功能参数后处死并收集部分肺组织置于-80 ℃冰箱保存,另取部分组织迅速以4%对聚甲醛固定,石蜡包埋后切片用于后续检测。

1.2.9大鼠呼吸功能参数检测 麻醉大鼠并固定后,切开其颈部皮肤暴露气管,借助动物呼吸机对各组大鼠最大肺活量(forced vital capacity, FVC)、最大呼气流速(peak expiratory flow,PEF)以及0.1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 0.1 second, FEV0.1)等指标进行测定。

1.2.10HE染色观察大鼠肺组织病理学变化 将组织样本进行常规石蜡包埋并切片,之后将组织切片置于二甲苯溶液中脱蜡,无水乙醇和梯度乙醇(95%、85%、70%)浸泡并水化切片。PBS冲洗,苏木精染色10 min,盐酸乙醇分化,双蒸水冲洗后行伊红染色,梯度乙醇脱水,二甲苯浸泡,中性树胶封片并在显微镜下观察。

1.2.11qRT-PCR检测MMP9的mRNA表达 TRIzol试剂盒完成总RNA提取,按照逆转录试剂盒的说明书将提取的RNA反向转录成互补DNA(complementary DNA,cDNA)。用SYBR®PreMix Ex TaqTM试剂盒进行mRNA定量检测,然后用2-ΔΔCt法进行分析。GAPDH作为MMP9的内参。

1.2.12Western blot检测MMP9蛋白表达 RIPA裂解液裂解组织和细胞中蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度。之后行SDS-PAGE凝胶电泳并且以湿转移法转膜。室温下封闭1 h后,用MMP9(1/1 000)和GAPDH(1/10 000)一抗孵育过夜。在用含有0.1% PBST的PBS洗涤3次,每次10 min,用山羊抗兔IgG(1/1 000)在37 ℃下孵育1 h。PBS冲洗,ECL显影并对蛋白条带进行观察,蛋白质水平通过GAPDH标准化,利用ImageJ软件对蛋白表达进行定量。

1.2.13香烟烟雾诱导构建COPD细胞模型 依据参考文献[8]制备香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)诱导的COPD细胞模型,首先将人支气管上皮(human bronchial epithelial, HBE)细胞保存在DMEM培养基(含10%胎牛血清)中,培养条件为37 ℃、5%CO2,培养24 h之后以浓度为4%的CSE处理HBE细胞48 h。细胞分组如下: HBE组(HBE细胞不做处理)、4% CSE组(COPD细胞模型组)、4% CSE+桑色素组(10 μmol/L、20 μmol/L或50 μmol/L的桑色素干预24 h后构建COPD细胞模型)。选取桑色素最佳干预浓度后再对细胞转染MMP9过表达载体,转染步骤借助Lipofectamine 3000试剂盒完成。

1.2.14MTT法检测细胞增殖活力 取各组对数生长期细胞,每组取4×103个细胞接种于96孔板,于37 ℃、5% CO2、100%湿度的培养箱内培养24 h后,分别加入20 μl的MTT溶液,继续孵育4 h,然后小心吸弃培养液,每孔加入150 μl的二甲基亚砜,避光震荡10 min,使结晶物充分溶解,用酶标仪于490 nm波长检测各孔吸光度从而对细胞活力进行判定。

1.2.15ELISA检测COPD细胞模型上清中炎性因子表达 取各组细胞,2 528 r/min的转速离心10 min并取上清液。借助试剂盒对细胞上清液中IL-6和TNF-α浓度进行测定。将待测样品以及稀释后的标准品分别加入50 μl在反应孔中,之后加入生物素标记的50 μl抗体,37 ℃温育1 h。之后加入80 μl亲和链霉素-HRP,震荡混匀。每孔加入A、B底物各50 μl,混匀并于37 ℃温育10 min。加入50 μl终止液,借助酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度值。

1.2.16Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒和流式细胞术测定COPD细胞模型的细胞凋亡率 在处理或转染后收集HBE细胞,在2 528 r/min的转速离心5 min,PBS洗涤3次并重新悬浮在结合缓冲液中,随后行Annexin VFITC和PI双重染色。最后,用流式细胞仪分析凋亡率。

1.3 统计学处理采用Graphpad Prism 8.0软件对该研究中实验数据进行分析,计量资料以均值±标准差的形式表示,多组间比较采用单因素方差分析,多组间数据两两比较采用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桑色素和COPD的共同作用基因靶点借助SwissTargetPrediction预测桑色素的基因靶点共发现96个基因靶点(图2A)。GeneCards、OMIM、DisGenet数据库分析共得到7 122个COPD基因靶点,将COPD基因靶点与桑色素基因靶点借助Venny网站取交集共得到67个共同作用基因靶点(图2B)。

图2 桑色素治疗COPD的基因靶点图

2.2 桑色素和COPD的共同作用基因靶点的互作用分析结果String网站对桑色素和COPD的67个共同作用基因靶点做PPI分析,之后导入Cytoscape进行拓扑学分析。拓扑学分析结果显示排名前5的作用较强的基因靶点包括SRC、MMP9、MMP2、PTGS2、FURIN(图3),SRC、MMP9和MMP2连接的蛋白数目更多(表1)。

表1 核心基因靶点的拓扑学参数

图3 PPI可视化结果

2.3 桑色素与关键基因靶点的分子对接将拓扑学参数排名靠前的基因靶点和桑色素进行分子对接,分子对接结合热能<-1 kcal/mol表示具有结合活性,<-5 kcal/mol表示结合活性较好;分子对接结果显示MMP9与桑色素的结合活性最强且形成氢键数目最多(表2、图4A)。此外KEGG分析结果显示(图4B)MMP9在IL17以及松弛素通路中富集,而IL17和松弛素均与COPD的发病存在关联,因此本研究选择MMP9进行后续分析。

表2 分子对接结果

图4 分子对接结果以及KEGG分析结果可视化

2.4 桑色素改善COPD大鼠肺组织病理损伤并且对MMP9表达的影响使用动物呼吸机对各组大鼠呼吸功能参数进行检测显示,与Control组比较,COPD组大鼠各呼吸功能参数均明显下降(P<0.01),而给予桑色素干预后各呼吸功能参数改善且80 mg/kg桑色素处理组改善效果更明显(P<0.01)(表3)。对各组大鼠肺组织病理学变化进行观察结果显示(图5A),Control组大鼠肺组织支气管管腔完整,管壁形态正常且无增厚情况,肺组织浅表层未观察到炎性细胞浸润;COPD组大鼠肺组织支气管管腔结构变形,管壁增厚且大量炎性细胞浸润;加入桑色素后大鼠肺组织支气管管腔变形改善,炎性细胞浸润减少,提示桑色素能够改善COPD大鼠肺组织病理损伤。进一步对各组大鼠肺组织中MMP9的mRNA和蛋白表达进行检测显示,相对于Control组,COPD组大鼠肺组织中MMP9的mRNA和蛋白表达明显增加(q=17.01,P<0.01;q=17.26,P<0.01)。但与COPD组比较,加入桑色素后MMP9的mRNA(q桑色素Ⅰ组=8.03,q桑色素Ⅱ组=11.95, 均P<0.01)和蛋白(q桑色素Ⅰ组=8.47,q桑色素Ⅱ(80 mg/kg)组=13.10,均P<0.01)表达被抑制(图5B、C)。

表3 各组大鼠呼吸功能参数(n=5)

图5 各组大鼠肺组织病理学变化和MMP9 mRNA和蛋白表达

2.5 桑色素对CSE诱导的COPD细胞模型细胞活力与MMP9 mRNA和蛋白表达的影响使用4%CSE处理HSE细胞构建COPD细胞模型并且给予桑色素处理,MTT检测结果显示(图6A)相对于HBE组,4% CSE组细胞活力明显降低(P<0.05);而相对于4% CSE组,随着桑色素处理浓度的增加,细胞活力也逐渐提高且50 μmol/L的桑色素对COPD细胞模型细胞活力的促进效果最佳(F=39.93,P<0.01)。进一步对各组细胞中MMP9的mRNA和蛋白表达进行检测显示,相对于HBE组细胞,4% CSE组的MMP9的mRNA和蛋白表达明显上调,而相对于4%CSE组,各浓度桑色素处理组COPD细胞模型中MMP9的mRNA和蛋白表达降低(FmRNA=26.27,F蛋白=37.15,均P<0.01)(图6B、C)。

图6 各组细胞活力和细胞中MMP9的mRNA和蛋白表达

2.6 桑色素对CSE诱导的COPD细胞损伤的作用对各组COPD细胞模型的细胞凋亡和炎性因子表达水平进行检测显示,相对于HBE组,4% CSE组的细胞凋亡明显增加,炎性因子浓度提高。在4% CSE处理的HBE细胞中加入桑色素后,COPD细胞模型的凋亡率和炎性因子浓度明显降低。但是桑色素对COPD细胞模型凋亡和炎性反应的保护作用被MMP9过表达载体逆转(F凋亡=79.95,FIL-6=65.68,FTNF-α=72.44,均P<0.01)。见图7。

图7 各组细胞凋亡率和炎性因子浓度

3 讨论

近年来中药单体在疾病治疗中的作用被逐渐揭示,桑色素作为一种桑科植物中分离的中药单体,其在抗炎、抗氧化中的作用十分显著[9]。本研究借助网络药理学技术,从药物成分-基因靶点-疾病出发,系统地分析桑色素作用于COPD的潜在基因靶点和机制,并且通过动物和细胞实验进行了验证。

首先本研究对桑色素和COPD的共同作用基因靶点进行预测,共得到67个共同作用基因靶点,拓扑分析发现共同作用基因靶点中作用更强的基因包括SRC、MMP9、MMP2、PTGS2、FURIN,而SRC、MMP9、MMP2连接的蛋白数目更多。Xu et al[10]在研究中发现复方甘草口服液能够通过抑制SRC/MAPK进而缓解COPD患者炎症和氧化应激。此外,MMP2和MMP9也被证明与COPD患者肺泡隔及肺功能有关[11]。PTGS2的多态性被证明与COPD的发病风险有关[12]。上述研究在一定程度上证实了本研究预测桑色素作用于COPD的基因靶点的价值。

进一步的分子对接结果表明桑色素与MMP9存在最高的结合能,KEGG结果也显示MMP9在IL-17通路以及松弛素通路中富集。Ding et al[13]证明IL-17在COPD急性加重期气道感染中起着有害作用,靶向IL-17是控制COPD感染的重要策略。另外也有研究[14]证明松弛素的一种亚型,H2型松弛素在COPD进展中发挥重要作用。因此,该实验将MMP9作为桑色素治疗COPD的核心基因靶点进行研究。

该研究表明桑色素能够改善COPD模型大鼠呼吸功能参数,减少肺组织病理变化并且抑制炎性反应。Shin et al[15]研究表明桑色素能够抑制MMP9的活性进而抑制血管平滑肌细胞的增殖并且改善动脉粥样硬化。本研究进一步研究表明桑色素能够显著抑制COPD大鼠肺组织中MMP9的表达。细胞实验中也证明了MMP9在COPD细胞模型中表达升高且桑色素能够抑制MMP9表达。另外,该研究则通过细胞实验证明了桑色素对COPD细胞模型炎性因子和细胞凋亡的抑制作用,且该作用可能是通过调控MMP9基因靶点实现。