金丝桃苷在主动脉弓缩窄所致心肌肥厚中的作用

张晓东,张艳涛,张 磊,董文婷,安慧仙,韩 杨,张 杰,刘治国,李 炜,王 伟

高血压是心血管疾病的重要危险因素,心脏是其主要受累器官[1]。当负荷增加时,心脏通过增加心肌细胞的面积适应血压的升高或血容量的增加,这种心脏重塑称为心肌肥厚[2],其能使心室壁压力减小并维持收缩舒张功能[3]。但随着心脏功能失代偿,最终导致心力衰竭[4]。研究[2]表明氧化应激、细胞凋亡和炎症等参与了心肌肥厚的形成。

金丝桃苷(hyperoside, Hyp)是从淫羊藿、金丝桃和贯叶连翘中分离得到的具有生物活性的黄酮苷[5]。研究[5-6]表明Hyp具有抗炎、抗氧化等药理作用。Hyp调控MAPK和NF-κB抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小胶质细胞炎症[7]。此外,有研究[8]指出Hyp激活NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)减轻心肌缺血再灌注损伤。Nrf2是一种转录因子,激活后转位到细胞核启动抗氧化酶的转录,如血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)[9]。最近研究[10]表明,激活Nrf2/HO-1信号可改善氧化应激诱导的神经细胞的神经毒性。然而,Hyp在压力负荷引起的心肌肥厚中的作用尚不明确,该研究旨在探讨Hyp对TAC所致心肌肥厚的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器40只SPF级雄性C57BL/6小鼠(8周龄,体质量20～25 g)购于西安交通大学动物中心,动物生产许可证:SCXK(陕)2018-001。将小鼠饲养于温度(25±1)℃,相对湿度(55±5)%,12 h/12 h昼夜交替的动物房中,实验方案经西安国际医学中心医院伦理委员会审查通过。Hyp(美国Sigma公司,货号:00180585),二氢乙啶(dihydroethidium, DHE)染料(美国Invitrogen公司,货号:D1168),TRIzol液(美国Invitrogen公司,货号:15596026CN),三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司,货号:10006818),异丙醇(国药集团化学试剂有限公司,货号:40064360),75%乙醇(国药集团化学试剂有限公司,货号:80176998),磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS,武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G0002-2L),蛋白酶抑制剂(武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G2006-250UL),RIPA裂解液(武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G2002-100ML),NADPH氧化酶2(NADPH-Oxidase 2, gp91phox,英国abcam公司,货号:ab129068),超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2, SOD2,美国Cell Signaling Technology公司,货号:13141S),Nrf2(美国Cell Signaling Technology公司,货号:12721S),HO-1(美国Cell Signaling Technology公司,货号:43966S),β-actin(美国Cell Signaling Technology公司,货号:3700S),逆转录试剂盒(北京Takara Bio公司,货号:RR036A),实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(北京Takara Bio公司,货号:639503),ML385(美国MedChemExpress公司,货号:HY-100523),山羊抗兔(北京中衫金桥生物技术有限公司,货号:ZB-5301),山羊抗鼠(北京中衫金桥生物技术有限公司,货号:ZB-2305),小动物超声仪(加拿大Fujifilm VisualSonics公司,型号:Visual Sonics770),激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司,型号:FV3000),实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司,型号:CFX96),Bio-rad化学显像发光仪(美国Bio-Rad公司,型号:ChemiDoc XRS+)。

1.2 动物模型建立和分组将40只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组10只:① 假手术(Sham)组;② 主动脉缩窄(transverse aortic constriction,TAC)组;③ Hyp处理TAC组(Hyp+TAC);④ Hyp和Nrf2抑制剂ML385共同处理TAC(Hyp+ML385+TAC)组。用2%七氟醚将小鼠麻醉后固定在恒温手术台上。参考先前研究[11]进行模型制备,Sham组和TAC组术后当天开始用生理盐水灌胃,Hyp+TAC组和Hyp+ML385+TAC组术后当天开始用Hyp(20 mg/kg·d)灌胃,Hyp+ML385+TAC组同时腹腔注射ML385(30 mg/kg),均持续4周,根据文献报道确定Hyp和ML385的给药时间和剂量[12-13]。

1.3 心脏超声检测术后4周,用2%七氟醚将小鼠麻醉后固定在恒温超声检测台上,将各组小鼠的心率控制在450～500次/min。采用VisualSonics770小动物超声仪经胸壁进行M超检测,检测指标包括左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)和左心室舒张末期后壁的厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole, LVPWd)。

1.4 心脏质量(heart weight, HW)/体质量(body weight, BW)比值计算实验结束后,用2%七氟醚将小鼠麻醉后称重并记录小鼠BW,快速颈动脉放血并摘取心脏,放入预冷的PBS中挤出心脏残存血液,用滤纸吸干后称取HW,计算各组小鼠HW/BW比值。

1.5 HE染色检测心肌横截面积,Masson染色检测心脏纤维化,DHE染色检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量计算各组小鼠HW/BW比值后,一部分心肌组织用4%多聚甲醛固定48 h后,石蜡包埋、切片。行常规HE和Masson染色;另外取部分组织用OCT包埋切片,按照DHE染色试剂盒说明书步骤进行染色,37 ℃水浴避光孵育15 min,用防淬灭液封片,激光共聚焦显微镜拍照。

1.6 qRT-PCR检测ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平术后4周,取部分心肌组织,采用Trizol法在冰上依次加入三氯甲烷、异丙醇和75%乙醇提取组织总RNA,逆转录试剂盒得到cDNA。用Bio-Rad CFX96实时定量仪检测ANP、BNP、β-MHC的mRNA水平,以GAPDH作为内参,引物由上海吉凯基因有限公司合成。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列表(5′-3′)

1.7 Western blot检测gp91phox、SOD2、Nrf2和HO-1的蛋白表达将各组小鼠左室心肌组织加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液,经研磨裂解、离心后保留上清,BCA法定量蛋白浓度;利用SDS-PAGE胶经电泳、转膜将蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,4 ℃条件下用gp91phox(1 ∶1 000)、SOD2(1 ∶1 000)、Nrf2(1 ∶1 000)、HO-1(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)一抗孵育过夜;经TBST洗3次后,用山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗(1 ∶5 000)孵育2 h,TBST洗3次;用Bio-rad化学显像发光仪检测条带,并用Image Lab软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 Hyp对各组心脏功能的作用心脏超声结果显示(图1),Sham组LVEF值为(76±2)%,LVFS值为(40.3±1.5)%,LVPWd值为(0.76±0.05)mm,结果显示TAC组的LVEF值(41.7%±3.1%)、LVFS值(23.3%±1.4%)低于Sham组(t=16.3,t=13.6,P<0.01),LVPWd值(1.27 mm±0.04 mm)高于Sham组(t=13.63,P<0.01);Hyp处理后,Hyp+TAC组的LVEF值(61%±3.9%)、LVFS值(34%±1.8%)明显升高(t=6.65、7.34,P<0.01),LVPWd值(0.91 mm±0.06 mm)降低(t=8.20,P<0.01);而Hyp联合Nrf2抑制剂ML385治疗后,与Hyp+TAC组相比,LVEF值(42.3%±4.5%),LVFS值(24.7%±2.1%)明显下降(t=5.36、5.60,P<0.01),LVPWd值(1.26 mm±0.04 mm)升高(t=7.90,P<0.01)。提示Hyp可以改善TAC组心脏功能。见图1。

图1 各组小鼠心脏LVEF、LVFS和LVPWd的水平(n=6)

2.2 Hyp对各组心肌横截面积和肥厚相关指标的影响HE染色(图2A)和qRT-PCR(图2B)结果显示,与Sham组相比,TAC组心肌横截面积增大,HW/BW比值(t=21.23,P<0.01)以及ANP(t=24.33,P<0.01)、BNP(t=21.17,P<0.01)和β-MHC(t=38.08,P<0.01)的mRNA水平明显增加;Hyp处理后,Hyp+TAC组心肌横截面积、HW/BW比值(t=8.20,P<0.01)以及ANP(t=9.70,P<0.01)、BNP(t=8.89,P<0.01)和β-MHC的mRNA水平(t=16.48,P<0.01)较TAC组降低;而Hyp联合Nrf2抑制剂ML385治疗后,Hyp+ML385+TAC组心肌横截面积、HW/BW比值(t=8.40,P<0.01)以及ANP(t=6.33,P<0.01)、BNP(t=8.41,P<0.01)和β-MHC的mRNA水平(t=10.80,P<0.01)较Hyp+TAC组增加。提示Hyp可以减轻TAC引起的心肌肥厚。

图2 各组小鼠心肌肥厚指标水平的比较 (n=6)

2.3 Hyp对各组心肌纤维化的作用Masson染色结果显示(图3),与Sham组相比,TAC组心肌纤维化增加;Hyp处理后,Hyp+TAC组心肌纤维化减轻;而Hyp联合Nrf2抑制剂ML385治疗后,Hyp+ML385+TAC组的心肌纤维化增加。提示Hyp可以改善TAC引起的心肌纤维化。

图3 各组小鼠心肌Masson染色图(×400)

2.4 Hyp对各组心脏氧化应激水平的作用DHE染色(图4A)和Western blot(图4B)结果显示,与Sham组相比,TAC组心肌DHE荧光增强,说明ROS含量增多,gp91phox表达增加(t=12.42,P<0.01),SOD2的表达降低(t=33.83,P<0.01);Hyp处理后,Hyp+TAC组DHE荧光减弱,说明ROS含量减少,gp91phox表达明显降低(t=9.60,P<0.01),SOD2的表达增加(t=9.19,P<0.01);而Hyp联合Nrf2抑制剂ML385治疗后,和Hyp+TAC组相比,Hyp+ML385+TAC组DHE荧光增强,说明ROS含量增多,gp91phox表达明显增加(t=11.23,P<0.01),SOD2的表达明显降低(t=8.60,P<0.01)。提示Hyp可以改善TAC引起的氧化应激。

图4 各组小鼠ROS、gp91phox和SOD2表达水平的比较(n=6)

2.5 Hyp对各组Nrf2和HO-1表达的影响Western blot结果显示(图5),与Sham组相比,TAC组心肌Nrf2和HO-1表达降低(t=22.92、32.15,P<0.01);Hyp处理后,Hyp+TAC组Nrf2和HO-1表达增加(t=11.41、9.30,P<0.01);而Hyp联合Nrf2抑制剂ML385治疗后,Hyp+ML385+TAC组Nrf2和HO-1表达较Hyp+TAC组相比降低(t=11.62、8.7,P<0.01)。提示Hyp可以调控TAC引起的Nrf2/HO-1信号的表达。

图5 各组小鼠Nrf2和HO-1蛋白表达水平(n=6)

3 讨论

心肌肥厚是心脏对生理病理因素的一种代偿机制,而持续的肥厚最终会导致心脏失代偿最终进展为心力衰竭[2]。关于心肌肥厚的病理机制已有较多报道,但目前仍然没有完全阐明。此外,临床上并没有针对心肌肥厚的治疗药物。因此,寻找有效的潜在治疗药物成为当务之急。

研究表明,Hyp具有抗病毒、抗炎、抗氧化和抗癌等生物活性[5-6],在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用[14]。同时,体内外研究[15]均表明,Hyp通过NF-κB信号诱导细胞凋亡和抑制细胞生长。然而,Hyp在心肌肥厚中的作用并不十分明确。本研究结果显示,Hyp能改善TAC组心脏功能,抑制心肌细胞横截面积、HW/BW值以及ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平。而ML385一定程度上阻断了Hyp在TAC中的保护作用。心肌纤维化是肥厚型心肌病的重要病理学特征,可导致心室功能障碍和心律失常[3]。本研究Masson染色结果表明,Hyp能减轻TAC引起的心肌纤维化,而ML385能阻断Hyp在TAC引起心肌纤维化中的作用。以上均说明Hyp在TAC引起的心肌肥厚中发挥保护作用。

已有证据表明,氧化应激在心肌肥厚的发生和发展中起着关键作用,可引起细胞功能障碍、蛋白质和脂质过氧化以及DNA损伤,最终导致不可逆的细胞损伤和凋亡[10]。而Nrf2信号在心肌细胞氧化应激的调控中发挥重要作用。已有研究[8]表明Hyp通过激活Nrf2信号通路,显著改善缺血再灌注损伤引起的左室舒张末压的升高和左室收缩压的降低。本研究结果显示,Hyp可降低TAC组ROS和gp91phox表达,增加SOD2的表达;同时,上调Nrf2和HO-1的表达。而ML385能阻断Hyp在TAC引起的氧化应激中的改善作用,并影响Hyp对Nrf2/HO-1信号的调控。

综上所述,本研究结果证明Hyp可通过抑制氧化应激改善TAC引起的心肌肥厚,这一作用可能与调控Nrf2/HO-1信号有关。本研究结果提示Hyp可能是防治压力负荷导致的心肌肥厚的一种潜在治疗药物,但仍需要临床实验进一步评估Hyp的作用。