circ RNA_0017178对戊四氮致癫痫小鼠模型的影响

毛 戬,温萍萍,孙洪英,张舒雅,孟晨曦,张 佳

癫痫是一种常见的神经系统疾病,特征是神经元过度同步放电出现短暂的中枢神经系统功能障碍,还伴有一定程度的心理障碍、行为障碍以及认知障碍[1]。目前全世界有超过7 000万的癫痫患者,其中约三分之一为难治性癫痫[2]。癫痫的反复发作、高病死率加重了癫痫患者的经济负担[3]。神经元高度同步异常放电是癫痫发作的根本原因,但具体的发病机制尚未明确。因此,研究癫痫的发病机制,寻找诊断和治疗癫痫的新方法尤为重要。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种闭环结构的非编码RNA,因其半衰期较长、表达稳定、不易降解等性质被广泛研究[4],其在脑组织中表达丰富,在神经元功能中起着重要作用。据报道[5],circRNA与多发性硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病有关,然而,由于癫痫发病的具体机制尚不明确,且目前关于circRNA与癫痫的研究相对其他疾病开展的较少,病变通路、作用靶点尚未明确。该研究旨在对癫痫患者及对照组进行基因芯片测序结果分析,并对circ_0017178在癫痫中的作用机制进行生物信息学预测,探究circ_0017178对戊四唑癫痫小鼠的行为学变化及海马细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料RNeasy Kit(美国安捷伦科技有限公司,货号:DXT-74404)、 TRIZOL(德国themro,货号:15596026)、反转录试剂盒(南京诺唯赞有限公司,货号:R211-01/02),Fioll淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司,货号:P8610),戊四唑(美国Sigma,货号:P6500),Tunel细胞凋亡检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司,货号:40308ES60),PBS洗液(上海源培生物科技公司,货号:B390KJ),人circRNA基因芯片(美国安捷伦科技有限公司,芯片ID085202)、SureScan Dx微阵列芯片扫描仪(美国安捷伦科技有限公司,型号:G5791A),Agilent Bioanalyzer 2100(美国安捷伦科技有限公司,型号:2100),qubit3.0定量仪(美国Thermo,型号:Qubit 3.0 Nanodrop 2000),PCR扩增仪(美国 ABI,型号:7500),脑立体定位仪 (上海玉研仪器有限公司,型号:SA-103-3),荧光倒置显微镜(日本 Olympus ,型号:IX73)。

1.2 基因芯片分析

1.2.1病例资料 收集2018年11月—2019年3月就诊于包头医学院第一附属医院癫痫门诊和病房以及包头市中心医院癫痫门诊的癫痫患者。纳入标准:符合2017年国际抗癫痫联盟癫痫发作和癫痫新分类标准[6]。排除标准:① 神经学检查或头颅磁共振发现颅脑肿瘤、血管损伤或畸形以及癫痫发作相关的脑软化灶;② 由头颅外伤、产伤或感染引发的癫痫; ③ 患有精神系统疾病、其它神经系统遗传性或发作性疾病或存在明显的智力障碍; ④ 3代家属内发现存在明确的癫痫病史。按照病例组年龄、性别匹配包头医学院第一附属医院体检健康人群作为健康对照组。该研究已通过包头医学院第一附属医院的伦理委员会批准,所有研究对象在抽血前均签署知情同意书。

1.2.2基因芯片测序 EDTA管收集受试者外周肘静脉血4 ml,依据Ficoll密度梯度离心法使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),按照TRIzol试剂盒说明书提供的标准操作流程提取样品的总RNA,并利用NanoDrop ND-2000定量检测纯度及浓度,使用qubit3.0荧光定量仪测定库浓度,应用Agilent Bioanalyzer 2100对RNA片段的大小进行精确测定和浓度定量,使用Agilent Bioanalyzer 2100系统软件检测总RNA的完整性,选取高质量的RNA样品用于后续芯片分析。应用人circRNA芯片鉴定差异性表达的circRNA。按照反转录试剂盒说明进行标记和扩增。随后使用荧光染料 Cyanine-3-CTP(Cy3) 进行标记,利用Agilent Scanner扫描得到原始图像。采用Feature Extraction软件(version12.0.3.1, Agilent Technologies)处理原始图像、提取原始数据;利用Genespring软件(version14.8, Agilent Technologies)进行数据的标准化和后续处理;使用火山图可视化两组之间的差异circRNA,并进行分层聚类以显示样品之间可区分的circRNA表达模式。本部分由北京阅微基因技术有限公司完成。

1.3 生物信息学分析使用circPrimer生信软件[7](www.bio-inf.cn/circPrimer)分析circ_0017178的组成及可能结合的腺苷酸N6位(N6-methyladenosine,m6A)的甲基化修饰位点、核糖体进入位点(internalribosome entrysite, IRES )和开放阅读框架(open reading frame,ORF)结合位点;使用circMir生物信息学软件(www.bio-inf.cn/circmir)自带的miRANDA工具和RNAhybird工具分别预测circ_0017178可能结合的miRNA,结果取交集得到的miRNA为circ_0017178可能结合的miRNA;使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_80/)生物信息学网站,将circMir所得的miRNA与癫痫基因可能结合的位点进行预测,预测结果以CWCS(cumulative weighted context++ score)评分分数进行评估,以CWCS分数<-0.1为最低的要求标准,使用Cytoscape构建circ_0017178相关miRNA及相关癫痫基因生物信息网络图。

1.4 动物学实验

1.4.1实验动物及分组 30只C57BL/6雄性成年小鼠(下文简称小鼠),周龄为12～13周,中位年龄12.5周,平均体质量为30～35 g,饲养环境温度(22±2)℃,湿度 50%～60%,光照暗室循环 12 h,自由食水,并且在进行实验前1周适应所生活的环境。本实验所涉及到关于动物的使用和护理都符合动物实验相关规定,并获得了动物伦理委员会的批准(伦理学批号:包医伦审动物2021第031号)。将小鼠随机分为3组:对照组、空载体腺病毒组(下文简称空载体组)、circ_0017178过表达腺病毒组(下文简称过表达组),每组10只。

1.4.2构建腺病毒载体并进行qRT-PCR检测 Circ_0017178过表达的质粒由由华大基因公司构建,腺病毒载体由汉恒生物公司根据腺病毒操作手册说明书进行构建。9只小鼠用来检测腺病毒载体的表达,随机分为对照组、空载体组、过表达组3只/组,分别向各组小鼠海马内注射生理盐水、空载体病毒载体、过表达腺病毒载体。1周后使用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测小鼠海马组织circ_0017178表达:参照TRIzol试剂说明书操作提取海马组织总RNA,按照逆转录试剂盒说明书反转录,按照上面的反应体系进行cDNA的合成逆转录反应体系,PCR仪中进行扩增,根据循环数阈值(cycle threshold,CT)值的结果,采用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达水平,引物序列见表1。

表1 qRT-PCR扩增引物序列表

1.4.3颅内立体注射转染腺病毒载体 腹腔注射0.4%戊巴比妥钠麻醉1.4.1和1.4.2项的小鼠,使用前囟进行颅骨标志法定位:前囟和后囟处于水平,之间的间距大约0～0.1 mm,以前囟出为“0点”,前囟向嘴侧的方向为“+”,向尾侧的方向为“-”。使用脑立体定位仪固定小鼠头部,剪去头部毛发后消毒,沿矢状缝切开3 cm的创口,缓慢分离皮下的相关组织,暴露小鼠的前囟、人字缝及矢状缝。将金属定位针置于矢状缝上方,定位针前囟确定标准中线后在前囟后方2 mm,矢状缝旁开2.5 mm处定位,即为海马平面所在位置。钻孔针颅骨钻孔后于下降2 mm处对双侧海马各注射1 μl的腺病毒液体,对照组注射等量的生理盐水。缝合皮下组织和头皮,对齐组织,用酒精对创口消毒。染毒后恢复1周,将1.4.2小鼠进行qRT-PCR检测circ_0017178的表达验证腺病毒构建情况,将1.4.1项小鼠用来构建戊四唑癫痫模型及检测海马组织细胞凋亡的情况。

1.4.4构建戊四氮癫痫小鼠模型 用0.9%生理盐水溶液将戊四氮配成100 mg/ml,每天上午9时到12时按照35 mg/kg对1.4.1项小鼠经腹腔给予戊四唑(pentylenetetrazole, PTZ)注射,持续21 d,每次注射完PTZ 后0.5 h内记录小鼠行为变化,按照癫痫发作程度的Racine评分[8]评估,具体的动物行为学观察内容包括:① 潜伏期:首次达到Racine 4级及以上的天数;② 发作频率:每次注射PTZ后癫痫小鼠的发作次数;③ 发作时间:每次注射PTZ后癫痫小鼠的发作时间。

1.4.5Tunel染色法检测海马组织细胞凋亡情况 腹腔注射50 mg/kg苯巴比妥钠麻醉1.4.1项分组小鼠,安乐死后提取海马组织制备切片。按照Tunel细胞凋亡检验试剂盒说明书对海马组织切片进行Tunel染色,使用荧光显微镜对样本的海马组织CA1区细胞凋亡情况进行检测分析计数。

1.5 统计学处理芯片数据利用差异倍数及t检验的P值进行差异circRNA的筛选:上调或者下调差异倍数≥2.0 且P值<0.05为有生物学重复性,上调或者下调差异倍数<2无生物学重复性;动物实验正态分布计量资料以平均值±标准差表示,不符合正态分布或方差不齐数据采用M(P25,P75)来表示;采用Levene 检验方差齐性,方差齐则使用独立样本t检验进行两组间比较;数据不符合正态分布或方差不齐时使用秩和检验进行两组间比较;计数资料使用卡方检验进行两组之间的比较。分别使用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析和做统计图,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例临床一般资料本研究纳入癫痫组(EP)和正常对照组(NC)受试者各3例,3组受试者按照病例组的年龄、性别匹配选出,一般临床资料见表2。

表2 病例临床一般资料

2.2 基因芯片分析结果

2.2.1总RNA质量 经qubit3.0定量仪检测两组总RNA的纯度和浓度,按照质量检测标准,A260/A280比值1.8～2.1则符合circRNA芯片实验要求;Agilent2100生物分析RIN≥7则样品RNA完整性良好。该研究癫痫组和对照组所有样本RNA 质量符合后续circRNA芯片实验的要求,见表3。

表3 癫痫组和对照组的总RNA质检结果

2.2.2circRNA表达谱分析结果 circRNA在癫痫组和对照组中表达倍数变化及统计学显著程度以火

山图呈现(图1A),根据circRNA表达水平的不同,经过图像采集和数据分析后筛选得差异circRNA(图1B)。与健康对照组对比,癫痫组差异性表达的circRNA 共21 988条,上调的circRNA 11 488条,下调的共10 500条;上调的circRNA中有6条(circ_0069272、circ_0073442、circ_0033065、circ_0033063、circ_0017178、circ_0049415)有生物学重复性(表4);下调的circRNA中有3条(circ_0083773、circ_0088262、circ_0016396)有生物学重复性(表5); 9条有生物学重复性的环状RNA中, circ_0017178的来源基因CHRM3与癫痫易感性有关。因此,接下来对circ_0017178进行生物信息学分析,并在动物实验中对circ_0017178与癫痫的关系展开研究。

图1 癫痫组和对照组环状RNA差异倍数火山图和RNA聚类图

表4 癫痫组与对照组相比显著上调的6条差异circRNA

表5 癫痫组与对照组相比显著下调的3条差异circRNA

2.3 生物信息学分析结果

2.3.1CircPrimer生物信息学软件分析结果 如图2所示,circ_0017178是CHRM3基因的表达产物,由CHRM3的外显子exon8聚合形成的外显子型环状RNA,含有127个碱基序列。使用“DEACH”功能发现circ_0017178可能结合的m6A甲基化位点一共有3个(表6),使用“高度匹配”功能发现circ_0017178可能结合的m6A甲基化位点为1个,位置位于27号位点,同时,circ_0017178具备1个ORF1和IRES的潜在结合位点。

图2 CircPrimer对circ_0017178的生物信息学分析图

表6 ORF与m6A结合位点信息

2.3.2CircMir生物信息学软件分析结果 circMir生物信息学软件分析circ_0017178可能结合的miRNA显示circ_0017178可能结合51个miRNA,RNAhybird工具分析显示circ_0017178可能结合299个miRNA,取交集共有26个miRNA。分别为:miR-363-5pmiR-3681-5p、miR-4298、miR-433-3p、miR-4433b-3p、miR-4436b-3p、miR-4475、miR-4651、miR-4740-3p、miR-4776-5p、miR-4786-5p、miR-4800-5p、miR-584-3p、miR-656-5p、miR-665、miR-6735-5p、miR-6736-3p、miR-6782-5p、miR-6847-5p、miR-6879-5p、miR-8071、miR-877-5p、miR-4632-5p、miR-6738-5p、miR-184、miR-4726-5p。见图3。

图3 CircMir对circ_0017178的生物信息学分析结果图

2.3.3TargetScan生物信息学网站预测 将26个miRNA与癫痫相关基因运用TargetScan,将取得的结果以CWCS<-0.1分为条件, 6个miRNA (miR-4632-5p、miR-6738-5p、miR-184、miR-4726-5p、miR-877-5p、miR-433-3p) 没有找到符合条件的癫痫基因,另外20个miRNA可以交互匹配到39个癫痫基因,共96条路线参与构成生物信息学网络。见图4。

图4 生物信息学预测得到的circ_0017178调控癫痫基因网络图

2.4 Circ_0017178对癫痫小鼠的影响

2.4.1qRT-PCR法检测circ_001718过表达腺病毒载体水平 1.4.2小鼠在对照组和空载体组中,未检测出circ_0017178的表达;在circ_0017178过表达组海马组织中,内参平均CT值为16.43,circ_0017178的平均CT值为24.54,表明circ_001718腺病毒载体构建成功。

2.4.2Circ_0017178对癫痫小鼠生物行为学变化的影响 1.4.1小鼠构建PTZ癫痫模型过程中,对照组小鼠死亡1只,9只小鼠成功构建PTZ癫痫模型;空载体组C57BL/6小鼠死亡2只,8只小鼠成功构建PTZ癫痫模型;过表达circ_0017178组C57BL/6小鼠死亡2只,8只小鼠成功构建PTZ癫痫模型。三组小鼠的潜伏期、发作时间、发作次数均符合计量资料正态分布,且方差齐(P>0.05)。与对照组及空载体组相比,circ_0017178过表达组癫痫的潜伏期明显缩短(t=12.78、13.39,均P<0.05)、发作时间明显延长(t=12.86、10.88, 均P<0.05)、发作次数明显增加(t=8.92、6.79,均P<0.05);空载体组及对照组间无差异。结果见图5。

图5 各组癫痫小鼠动物行为学结果统计分析图

2.4.3Circ_0017178对癫痫小鼠海马组织细胞凋亡的影响 在1.4.1中对照组、空载体组、过表达组三组癫痫小鼠海马CA1区中可见红色荧光信号(红光代表细胞凋亡),相比于对照组和空载体组,过表达组海马组织CA1区荧光信号更强。见图6A。采取图像分析计数,卡方检验结果显示空载体组和对照组之间细胞凋亡率差异无统计学意义(χ2=0.66,P>0.05),过表达组的细胞凋亡率明显高于对照组和空载体组(χ2=49.38、41.11,均P<0.05)。见图6B。表明,相比于空载体组和对照组,Circ_0017178过表达组海马组织CA1区细胞凋亡更严重。

图6 Tunel染色细胞凋亡结果

3 讨论

CircRNA在疾病中的功能是结合miRNA以“分子海绵”发挥作用,此外,还具备吸附蛋白 、调控其它基因转录 、干扰其它基因剪接 、翻译多肽、作为生物学标记物等多种功能[9],目前circRNA在癫痫中的研究很少。本研究结果表明circ_0017178与癫痫密切相关。

circRNA发挥功能与其来源的位置密不可分,circRNA根据其来源分为外含子circRNA、内显子circRNA以及外含子-内显子混合的circRNA。外显子circRNA在细胞质中稳定表达,可以与miRNA或RNA结合蛋白相互作用,甚至包绕具备翻译起始密码子的区域,可能在基因表达和翻译中发挥调节作用[10]。相比之下,内显子circRNA更多位于细胞核中,受其他因素干扰较小,表达稳定[11]。外显子-内含子circRNA同时具有外显子和内含子circRNA特征。本研究通过circPrimer生物信息学软件分析发现circ_0017178为外显子型circRNA,其可能具备“分子海绵”的功能结合miRNA调节癫痫基因的表达在癫痫中发挥作用。本研究结果显示circ_0017178可能结合的miRNA共有26个,运用TargetScan匹配发现其中20个miRNA匹配到39个癫痫基因,共96条ceRNA通路。

本研究显示circ_0017178在结构上不仅具备m6A甲基化的位点,还具备与ORF1、IRES结合的位点。研究[12]表明m6A修饰会影响circRNA的发生、翻译、降解和细胞定位,在circRNA的代谢过程中起到生理或病理生理调节作用。m6A可能促进circRNA的翻译能力[13]。IRES、ORF和m6A修饰三个基本元素赋予circRNA 编码蛋白质的独特能力,从而具备翻译的潜力[12]。因此circ_0017178的 具备的m6A结合位点可能通过表观遗传学在癫痫中发挥作用,circ_0017178甚至还具备翻译的潜能。

研究表明[14]circRNA可能通过影响神经元凋亡过程从而对癫痫产生影响。细胞凋亡是一种细胞程序性的死亡,受到严格的程序性生物控制。细胞凋亡有利于维持多细胞生物组织和器官的完整性和平衡性,使机体更容易适应体内不断变化的环境,对生物具有特殊的意义[15]。本研究癫痫小鼠体内实验发现circ_0017178过表达后可以更加快速地诱发癫痫发作,以及加重癫痫的严重程度,同时利用Tunel染色观察到过表达circ_0017178后加剧了癫痫小鼠海马组织的凋亡程度,这表明circ_0017178可能通过促进细胞凋亡参与癫痫的发生和发展。

本研究亦存在不足,如仅运用PTZ癫痫模型进行了实验,仅运用Tunel染色验证细胞凋亡,因此在后期实验中将设计实验构建其他癫痫模型进行重复实验,同时用检测Capase-3、死亡受体等方式多维度对细胞凋亡进行研究;生物信息学方面,将进一步探究circRNA-miRNA-mRNA的相互关系。随着生物学技术的发展和circ RNA 研究的不断深入,未来将更深刻的了解circRNA与癫痫的关系,为癫痫防治提供新的方法,为治疗策略及新药研发开辟新的切入点。