CRISPR/Cas应用于核酸特异性检测及其在检测SARS-Cov-2病毒中的应用

汪 琼 综述 刘 飞,柳传祺,王效静,陈付凉 审校

SARS-CoV-2病毒感染导致的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19),引起世界范围内严重的卫生健康问题[1]。截止2023年3月26日, 全球COVID-19已造成超过7亿人感染,累计680万以上患者死亡[2]。在目前的COVID-19疫情防控中,主要通过SARS-CoV-2病毒核酸检测确诊感染人群,采取的技术手段主要包括实时荧光PCR(real-time PCR,RT-PCR)、下一代测序(next generation sequencing,NGS)和血清学抗体检测。RT-PCR技术是现阶段使用最广泛的SARS-CoV-2检测技术,在2～4 h内即可提供检测结果,被视作检测SARS-CoV-2病毒的金标准。但由于受采样不当、病毒载量低、引物设计局限以及病程变化等因素影响,导致临床样本检测中出现假阴性现象[3]。RT-PCR检测主要缺点为:① 需要PCR扩增仪;② 需要专门的技术人员;③ 对实验室环境要求高;④ 检测周期相对较长等。NGS技术在检测的灵敏度、特异度等方面相对于PCR技术有一定的优势,但因其操作程序复杂,检测周期更长,检测成本高等不利因素,大大限制了其在疫情防控中的推广和应用。血清特异性抗体检测,可在15 min内快速检出结果,而在症状出现前的5～14 d潜伏期,由于血液样本中IgM或IgG抗体滴度低,血清学检测的假阴性结果可能较高[4-5]。因此,新型核酸分子检测方法亟待研究开发。近年来,随着对规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated systems,CRISPR/Cas)系统研究的深入,发现该系统在分子检测领域有巨大潜力。该文主要介绍CRISPR/Cas系统及其在分子诊断中的演进,并重点介绍CRISPR/Cas诊断技术在SARS-CoV-2病毒核酸检测中的研究现状。

1 CRISPR/Cas系统来源和基因编辑技术的应用

作为病毒最广泛的宿主,细菌在进化过程中具备了针对病毒的先天性和适应性免疫系统,先天性免疫系统主要通过限制性内切酶、修饰酶识别并切割外源DNA来清除入侵的病毒[6],适应性免疫系统主要包含CRISPR/Cas系统,其主要功能是识别外源性核酸(如入侵的病毒核酸等)并进一步对其剪切、清除,以维持机体内环境的稳定[7]。

CRISPR序列与Cas蛋白酶为适应性免疫系统两大重要组成部分。CRISPR存在于90%古生菌以及近40%细菌基因组中,由末端重复元件(repeat)和间隔序列(spacer)组成[8]。Spacer储存着外源性核酸信息,能够翻译成小引导RNA(small guide RNA, sgRNA)。Cas蛋白酶决定了CRISPR/Cas系统的工作方式及功能特征,其种类繁多。在自然界中,根据介入模块构架,广义上将Cas蛋白分为两大类,第一类通常依赖多蛋白复合体发挥生物功能;而第二类通常使用单个效应蛋白发挥生物功能[9]。Cas9为第二类家族Ⅱ型蛋白,拥有RuvC以及HNH核酸酶结构域,能切割双链DNA。当外源核酸入侵细菌,sgRNA能够识别外源核酸并完成碱基配对,引导Cas9蛋白将识别的外源核酸切割、降解,以此来清除入侵的核酸[10]。

CRISPR/Cas9系统被广泛应用于真核、原核细胞生物核酸切割、修复。对Cas9蛋白进行结构改造,可以赋予CRISPR/Cas系统新的功能。如将RuvC/HNH元件替换成转录激活因子或抑制因子,则可构建CRISPR/dead Cas9(dCas9)系统,用以实现对靶基因的内源激活或沉默[11]。大鼠胞嘧啶核苷脱氨酶rAPOBEC1通过linker序列XTEN连接到dCas9的N端,可以构建单碱基编辑(base editor, BE),可将胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),实现单碱基水平碱基转换功能[12]。由此看出,Cas蛋白及其衍生体可以赋予CRISPR/Cas系统多样化功能。

2 CRISPR/Cas应用于核酸检测技术的研究进展

2.1 Cas13a蛋白的发现及初应用2015年,Shmakov et al[13]用Cas1作为诱饵成功筛选出了LbaCas13a蛋白。Cas13a为2类家族Ⅵ型蛋白,拥有原核、真核生物核苷酸结合结构域,具有RNase活性,在sgRNA引导下在基因组靶向区域发挥生物学功能。Cas13a蛋白除了具有核酸剪切功能外,还具有多种独有的特征,包括:① CRISPR/Cas13a识别的靶分子是单链RNA,而非DNA;② CRISPR/Cas13a 识别、结合靶RNA分子后,Cas13a蛋白被激活,不仅能特异性切割靶RNA分子,还获得了附带切割活性(collateral cleavage activity, CCA)-非特异性剪切其他RNA分子的功能[13]。2016年,Doudna教授[14]首次利用Cas13a蛋白CCA功能,创造性将CRISPR/Cas13a技术引入RNA核酸分子检测的应用研究。该研究在CRISPR/Cas13a反应体系中加入报告RNA分子系统(荧光素-报告RNA分子-荧光淬灭基团),当“导向RNA分子”与环境中的“检测RNA分子”完成碱基互补配对后,Cas13a蛋白就会被“导向RNA分子”招募到“检测RNA分子”识别位点并活化,随即将“检测RNA分子”特异性降解以及通过CCA活性将“报告RNA分子”非特异性降解,从而将荧光素从淬灭基团中释放出来。荧光信号的检测间接指示环境中存在“检测RNA核酸分子”。通过CRISPR/Cas13a方法成功检测出了溶液中含有的噬菌体RNA(灵敏度:0.01 nmol/L)[14]。该研究发现奠定了CRISPR/Cas技术应用于核酸分子诊断领域的基础。

同年,张锋团队[15]将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA,工作原理见图1)技术引入CRISPR-Cas13a(LwaCas13a)检测系统,开发出了灵敏性更高的夏洛克(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)检测技术,其检测灵敏性达到了渺摩尔(attomolar,amol/L或10～18 mol)级别(图2A),且反应体系在常温下即可完成。利用SHERLOCK技术已成功在病毒感染患者血清或尿液里检测到浓度低至每微升含单一拷贝的寨卡病毒基因,在肺癌患者血液中检测到丰度低至0.1% EGFR突变基因[15]。RPA技术主要包含三种酶,常温下能结合核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding protein,SSB)和链置换DNA聚合酶。在常温下,聚合酶与引物复合体对基因组进行扫描,当引物与基因组序列相同时,引物与其中一条DNA链进行匹配,另一条游离链随即被SSB进行结合。引物与DNA结合后,DNA聚合酶随即对模板进行扩增。该步骤进行多个循环,即可实现常温下靶向DNA核酸片段扩增。图1引自文献[16],在此基础上进行修改。

图1 RPA常温DNA扩增技术原理图

图2 CRISPR/Cas检测技术原理图

2.2 Cas13a蛋白亚族的发现及应用后续研究[17]表明,Cas13a可以被分为两个亚族,不同亚族Cas13a配套的导向RNA具有不同的辅助序列(direct repeat,DR),且非特异性剪切“报告RNA”时对序列具有不同的偏好性。此外,Cas13b蛋白作为Cas13蛋白家族另一个亚型,同样具有靶向RNA的效应功能和干扰功能,其“导向RNA”同样具有独特的结构以及独特的位点识别特征。这些发现为以后设计多重诊断提供了选择工具[17]。2018年,Doudna与张锋[18-19]实验室均发现,Cas12a蛋白介导的CRISPR/Cas系统能够识别单链及双链DNA,一旦被激活,Cas12a能够非特异性剪切、降解单链DNA。Doudna团队[18]因此开发了Cas12a-DETECTR检测系统,该系统省去了重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)扩增后产物(DNA形式)需要用T7酶转录成RNA的环节,使得反应体系进一步简化(图2B)。张锋[19]则在CRISPR-Cas12a的基础上,对早期SHERLOCK技术进行迭代升级,从多重化、定量化和去荧光化角度对SHERLOCK技术进行完善。完善后的SHERLOCK技术能够同时检测多种RNA病毒,以及RNA病毒和DNA病毒混合样本的多个位点(图2C),并通过颜色对样本核酸进行判读,减少检测仪器的使用(图3);该团队还将加热灭活技术(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases,HUDSON)引入SHERLOCK检测体系,HUDSON技术能够对样本RNA核酸酶和病毒进行热灭活,从而省略核酸提取环节,可以在患者血清、唾液等样本中直接完成核酸检测[20]。Doudna[21]后续研究表明,Cas14蛋白能够靶向识别单链DNA,并基于此开发了Cas14-DETECTR检测体系,其识别靶序列不受前间隔序列邻近基序限制,但需要靶向序列严格匹配,因此,该体系可检测出单个碱基变异,并且扩大了sgRNA的设计范围。检测流程包括:DNA或cDNA(RNA反转录)样本在常温下采用RPA进行扩增,扩增产物(DNA形式)在T7转录酶的作用下转录成mRNA,转录产物作为CRISPR-Cas13a的反应底物进行核酸检测(图2A),DNA分子或者cDNA (RNA反转录)在RPA技术扩增后,直接作为CRISPR/Cas12a底物,在常温下进行检测,如图2B,图引自文献[18],在此基础上进行修改;升级版SHERLOCK技术对RNA核酸样本(ssRNA,ZIKA病毒核酸,DENV病毒核酸)、DNA核酸样本进行多重检测,信号分别通过FAM、TEX、Cy5以及HEX显示出,如图2C图,引自文献[19]在此基础上进行修改。

图3 CRISPR/Cas13技术检测SARS-CoV-2基因组模拟物结果

2.3 更多的Cas蛋白家族被开发应用Cas12,Cas13以及Cas14等蛋白首先特异性结合靶向核酸分子,并完成剪切功能(如破坏病毒核酸),随后非特异性切割报告基因,这样检测人员就可以通过颜色变化进行结果判断。Sabeti et al[22]基于这些蛋白的双重功能属性,开发了“雕刻者”(Cas13-assisted restriction of viral expression and readout,CARVER)技术。CARVER技术不仅能诊断出细胞感染的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、甲型流感病毒和单纯疱疹病毒,而且还能实现有效清除细胞内病毒并指示残余病毒含量等三重功能。

3 CRISPR/Cas技术在SARS-Cov-2病毒核酸检测中的应用

随着等温扩增技术的引入,CRISPR/Cas与等温扩增相结合具有多种优势(表1)。等温扩增技术不需要热循环系统就能够进行核酸扩增。相比于常规PCR需要经过严格的高温变性、退火、延伸的等步骤才能模拟体外的DNA分子扩增,等温扩增技术使用的温度为恒温,且具有快速、高效、特异性高等优点。此外,它不需要专门的设备。基于等温扩增原理研发出来的新型核酸扩增技术分别为环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[23]、RPA[16]、链置换扩增技术(strand displacement amplification,SDA)[24]和指数扩增反应(exponential amplification reaction,EXPAR)[25]。

表1 几种CRISPR结合等温扩增检测方法的比较

在疫情爆发后不久,国内学者利用Sherlock技术针对COVID-19患者的样本进行测试,并与RT-PCR方法、抗原抗体检测法进行比较,发现Sherlock技术灵敏度高于其他两种方法[26]。夏洛克技术最先是采用RPA技术对核酸进行42 ℃等温扩增(扩增前在同一体系进行RNA核酸逆转录),接着对扩增产物行CRISPR/Cas13a技术检测(检测前在同一体系对扩增产物进行转录),最后采用可视化的方法对信号进行判读(图3A、B)。胶体金试纸条信号指示分子设计:Biotin-报告RNA分子-FAM。报告RNA未被切割,金纳米颗粒-FAM抗体-FAM-报告RNA-Biotin耦合物被Streptavidin滞留在一线,二线不显色;如RNA被剪切,金纳米颗粒-FAM抗体-FAM-被释放,能在二线被Protein A滞留并显色(绿色箭头所示)。二线颜色的有、无间接指示环境中待检测核酸分子有、无,图3A、3B引自文献[27],在此基础上进行修改。引导RNA与靶向核酸的精确互补配对,决定了CRISPR/Cas系统的检测特异性。在RPA阶段,核酸分子得到充分扩增。单个激活的Cas13a蛋白能够非特异性剪切多个报告RNA分子,释放更多的信号基团使得检测信号被二次放大。相比基于RT-PCR核酸检测法,CRISPR/Cas13a系统在检测SARS-CoV-2核酸中具有更高的灵敏度。在对SARS-CoV-2病毒核酸复制模拟物行CRISPR/Cas13a技术检测时,其检测下限能达到20～200 amol/L)浓度。病毒核酸的提取时间不计在内,整个检测流程可以在1 h内完成。同时,该系统具有仪器设备要求低、检测成本低(约0.6美元/反应)等优点。因此,CRISPR/Cas系统在未来COVID-19患者检测中展现出了强大的潜在应用价值。

此外,Broughton et al[28]将RT-LAMP和CRISPR-Cas检测结合,在单一温度下60 min内即可得到核酸检测结果。最近,Hu et al[29]为简化检测流程,利用一条光敏感基团连接的短RNA(inhibitory RNA)与crRNA形成二聚体,可抑制crRNA正常折叠并干扰其活性,该二聚体在365 nm波长紫外线照射下可实现crRNA去抑制。通过引入一个含有PC连接子的保护性寡核苷酸链,实现了CRISPR/Cas12a活性的暂时沉默,使其能够在同一个反应体系中进行等温扩增与CRISPR/Cas识别、检测,避免了CRISPR系统的裂解活性造成的扩增抑制。在对60份临床SARS-CoV-2 RNA样本的O-gene和N-gene的分析中取得较高的检测灵敏度和特异度。

对于SARS-CoV-2等RNA病毒核酸的检测,与诸多传统检测法类似,光控CRISPR法仍需要引入逆转录,实现RNA到DNA的转化,从而增加了整个反应体系的复杂度及检测成本。2021年,一种无逆转录指数扩增反应RTF-EXPAR完美规避了反应前的逆转录过程,极大缩短了反应时间(10 min内检测出结果),实现了SARS-CoV-2病毒检测。该体系利用BstNI核酸内切酶选择性剪切DNA:RNA杂交双链中的DNA链,实现从病毒RNA中酶解产生触发DNA(trigger DNA)的无逆转录过程,trigger可启动EXPAR反应并将病毒RNA信号快速转化为大量短的双链DNA片段(short double-strand DNA,sdsDNA),实现病毒的快速检测[30]。近日,Wu et al[31]提出了一种基于电化学CRISPR传感技术的新型冠状病毒变异株检测方法,该方法在金电极上均匀地修饰电沉积的金纳米颗粒,采用与SARS-CoV-2 Delta spike基因序列相同的DNA模板作为模型,可在1 h内完成检测,具有较高的稳定性和特异性。Li et al[32]将石墨烯和电化学及纳米技术应用到CRISPR/Cas检测体系优化和改造生物传感器以提高检测效率、降低成本。为了方便结果读出,Ma et al[33]开发了一种具有智能手机读数的CRISPR-Cas12a视觉生物传感器,用于检测SARS-CoV-2。简单地说,SARS-CoV-2衍生的核酸触发了基于CRISPR-Cas12a的单链DNA的任意降解,而单链DNA原本连接两个金纳米颗粒,这导致了金纳米颗粒的解聚,从而产生了可观察到的颜色变化。这一变化可以通过带有Color Picker App的智能手机轻松识别。当然,CRISPR/Cas系统在核酸检测领域也面临着挑战:① 临床测试数据采集周期较长;②CRISPR/Cas系统类别较多,且各系统拥有独特的属性(表2),在诊断应用领域尚未形成统一标准;③ CRISPR/Cas系统所需配套试剂尚未统一商品化;④ 核酸片段被大量扩增,高浓度核酸易造成污染;⑤ 多人混检,难以评估样本中患者病毒载量;⑥ RNA引物序列、crRNA序列需要反复优化以降低核酸病毒检测中的脱靶效应。这些因素减缓了CRISPR/Cas系统的临床应用进程。

表2 Cas蛋白家族介导的分子诊断平台各自属性

4 展望

综上所述,CRISPR/Cas系统在分子诊断领域应用研究开发时间虽不足十年,但发展迅速,已经有多款检测试剂盒被开发应用,可见其在COVID-19患者临床检测中具有很高的应用价值。目前,美国食品药品监督管理局已经为一些基于 CRISPR 的诊断技术授予了紧急使用授权,未来有望成为普适性的分子诊断工具。在对所有试剂和反应条件进行系统的优化后,将会达到与PCR相同甚至更优越的检测性能。相信未来通过大规模临床样本测试以及进一步条件优化, CRISPR/Cas系统能够在SARS-CoV-2和其他病原体临床检测中得到广泛应用。该技术的成功实施能进一步完善COVID-19疾病的诊断、筛查和防控体系并完善我国各领域分子诊断体系。