针刺对卵巢早衰患者血清激素及生殖道菌群的影响

卓缘圆,宁 艳,林彦廷,李艺彤,黄杏贤,谭利亚,吴家满△

(1.深圳市中医院,广东 深圳 518033;2.南方医科大学附属深圳妇幼保健院,广东 广州 518028;3.广州中医药大学,广东 广州 510405)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)为女性在40岁之前出现卵巢功能减退[1],主要表现为促性腺激素水平升高和雌激素水平降低[2],伴有不同程度的潮热多汗、面部潮红与性欲低下等症状,对患者生活质量与身心影响甚大[3]。卵巢早衰的病因和发病机制尚未明确,但随着研究的深入,更多学者不仅仅单纯地局限于下丘脑-垂体-性腺轴,更多地关注点集中在遗传、免疫与代谢等因素[4-5]。

许多研究已证实,针灸是治疗POF的一种安全并有效的方法[6-7],目前的研究认为针刺是通过激活多巴胺系统调控生殖轴、调整血清性腺激素和促使生殖内分泌系统恢复正常生理之动态平衡[8]。女性生殖道菌群与人体免疫、代谢相关,对生殖和后代健康有重大意义,相关的研究也越来越受关注。笔者前期研究发现：与健康人群相比较,卵巢早衰患者生殖道菌群有显著变化,这些变化与血清激素显著相关[9]。笔者认为针灸可能通过对生殖道菌群及其代谢产物的良性调控从而改善生殖道菌群的丰度及多样性,进一步激活“下丘脑-垂体-卵巢”的功能[10],从而治疗POF。因此,本研究通过观察针刺对POF患者血清激素及生殖道菌群的影响,初步探索针刺的疗效机制,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入的20例卵巢早衰患者均来源于2020年3月—2020年9月在深圳市妇幼保健院中医科门诊的患者,同期通过面向社会公开招募健康受试者作为对照组。最终该试验获得病例数为治疗组20例、对照组20例,共40例样本。经统计分析,两组患者的平均年龄和体重指数(BMI)差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。该研究方案已获得深圳市妇幼保健院伦理委员会批准(伦理号：SFYLS2020-012),所有参与者均自愿参加并签署知情同意书。该研究在中国临床试验注册中心登记注册(登记号：ChiCTR2000029576)。

表1 两组临床特征比较

1.2 诊断标准

POF诊断标准参照曹泽毅主编《中华妇产科学》[2](第3版)中诊断标准：患者最早期表现为生育力下降,中晚期出现排卵减少、月经欠规律,甚至出现继发性闭经。患病前月经改变的形式多样：有月经稀发、不规则子宫出血或闭经等;雌激素缺乏的表现：有出汗、潮热、外阴干涩、阴道烧灼不适感、尿频、排尿困难、失眠、抑郁与记忆力下降等;40岁前绝经。实验室检查：第1次测定血清促卵泡生成素(FSH)>40 U/L,间隔1个月复测FSH持续升高,雌二醇(E2)<73.2 pmol/L。B超显示子宫偏小或者正常,卵巢未见卵泡显影。

1.3 纳入标准

①符合诊断标准;②18岁≤年龄<40岁;③治疗前至少3个月未使用过任何治疗POF的药物(应急处理除外);④治疗前至少1个月未接受治疗POF的针灸操作;⑤治疗前至少1个月未使用抗生素类药物;⑥有性生活史且试验期间进行性生活需全程佩戴安全套;⑦自愿参与本项研究并签署知情同意书。

1.4 排除标准

①先天因素生殖器官发育异常;②染色体核型异常者;③合并严重心脑血管、肝、肾、恶性肿瘤、造血系统及精神疾病者;④入组前1个月内有生殖道感染性疾病或阴道用药史;⑤拒绝签署知情同意书者。

1.5 针刺治疗

治疗组采用中国针灸学会病例注册登记研究联盟卵巢早衰项目组推荐的针灸方案进行针刺干预[11]。取穴分两组交替使用：穴组1：百会、神庭、本神(双)、肓俞(双)、关元、大赫(双)、卵巢(双)、足三里(双)、三阴交(双)、太溪(双)和太冲(双);穴组2：肾俞(双)、次髎(双)。

患者取适当体位(穴组1取仰卧位,穴组2取俯卧位),穴位进行局部皮肤常规消毒。肓俞、关元、大赫、卵巢、足三里、肾俞：采用0.25 mm×40 mm环球牌一次性无菌不锈钢针灸针(苏州针灸医疗用品有限公司生产,批号：160602)直刺25～30 mm。三阴交、太溪、太冲：采用0.25 mm×25 mm针灸针直刺15～20 mm;百会、本神和神庭：采用0.25 mm×25 mm针灸针向后平刺15～20 mm;次髎：采用0.25 mm×75 mm针灸针向正中线斜下刺入第2骶后孔中50～60 mm。所有腧穴均以得气为度。留针30 min,穴组2连接电针,疏密波,以患者耐受为度。隔天治疗1次,穴组1与穴组2交替使用,12次(1个月)为1个疗程,共治疗3个疗程(3个月)。

1.6 观察指标

1.6.1 血清性激素水平 针刺前后分别收集所有研究对象(未闭经者在月经期2～3 d,闭经者无时间限定)清晨空腹静脉血5 mL,分离血清,采用全自动生化分析仪进行血清FSH、LH、E2和AMH水平的检测。

1.6.2 生殖道菌群结构与多样性 采用一次性无菌采样拭子取生殖道后穹隆处分泌物,在后穹隆处缓慢旋转3～5周,立即折下采样拭子前段,密封放置在2 mL无菌冻存管中,-80 ℃低温冰箱保存。

采用16S rRNA扩增子测序(16SrRNA Amplicon Sequencing)。用双端引物扩增构建文库后,基于Illumina Nova测序平台测序,然后进行双末端(Paired- End)测序,在测序数据质控,序列组装,污染去除后,将序列聚类成为ASV(Amplicon sequence variants)并比对数据库进行物种注释。进一步计算菌群结构与alpha和beta多样性,并进行组间差异的比较,分析样本群落结构的差异特征。采用5 LEfSe分析显著差异细菌类群(以5 LEfSe>2分为筛选标准)。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 治疗组针刺前后血清性激素水平比较

治疗组经针刺治疗后,血清FSH和LH水平较治疗前降低,E2和AMH水平较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 治疗组在针刺前后基础血清性激素比较

2.2 生殖道菌群结构和多样性比较

2.2.1 生殖道菌群门水平相对丰度分析 治疗组与对照组生殖道菌群门水平相对丰度比较：治疗前,治疗组变形菌门、放线菌门较对照组多,差异具有统计学意义(P<0.05),厚壁菌门、拟杆菌门两组比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,治疗组变形菌门、放线菌门较对照组少,拟杆菌门、厚壁菌门较对照组多,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为治疗组(针刺前);B为治疗组(针刺后);C为对照组。图1 两组生殖道菌群门水平相对丰度比较

注：A为治疗组(针刺前);B为治疗组(针刺后);C为对照组。图2 两组生殖道菌群复杂度比较

注：A为治疗组(针刺前);B为治疗组(针刺后);C为对照组。图3 两组生殖道差异菌属的筛选

2.2.2 生殖道菌群复杂度比较(Alpha diversity) 治疗组与对照组生殖道菌群Alpha多样性比较：治疗前,治疗组生殖道菌群Shannon指数较对照组低,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,治疗组生殖道菌群Shannon指数较针刺前升高,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.2.3 差异菌属的筛选 治疗组与对照组差异菌属水平比较：治疗前,治疗组生殖道菌群奇异菌属、链球菌属和普雷沃氏菌属较对照组少,加德纳氏菌属较对照组多,差异具有统计学意义(P<0.05)。 治疗后,治疗组奇异菌属、罗伊氏乳杆菌属和普雷沃氏菌属较对照组多;双歧杆菌属、加德纳氏菌属和链球菌属较治疗前减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

针刺治疗前,治疗组和对照组共发现12个差异菌群。仅存在于治疗组的生殖道的菌群有9个(亨盖特梭菌科Hungateiclostridiaceae、梭菌科Fastidiosipila、热纤梭菌Clostridia、巨球型菌属Megasphaera、微小微单胞菌Parvimonas、马林鱼科Marinifilaceae、嗅杆菌科Odoribacter、拟杆菌目g-Muribaculaceae和拟杆菌目f-Muribaculaceae);仅存在于对照组的生殖道菌群有3个(拟杆菌门P-Bacteroidota、拟杆菌门C-Bacterodia和拟杆菌门o-Bacterodiales)。见图4。

注：A为治疗组;C为对照组。图4 两组针刺干预前生殖道显著差异细菌类群比较

针刺治疗后,治疗组显著差异细菌类群的相对丰度与针刺前比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

临床上发现很多早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)的患者在初次就诊时已是POF状态,因雌激素缺乏而引起的绝经相关症候群、生殖道萎缩、生育能力下降或丧失等生殖健康问题给患者的家庭带来很大的影响。现代研究表明,FSH、LH水平的降低和E2水平的提高是目前治疗卵巢早衰的关键[12]。中医文献中并无卵巢早衰病名,根据临床表现将其归于中医学“经水早断”“经闭”“血枯”等范畴[13],POF的主要症状表现是闭经,而中医认为闭经的主要病因病机比较复杂,但以精血亏虚、血海不足和血无可下为主[14];目前,临床上中医多用中药辨证论治联合传统中医治法比如针刺、穴位埋线和耳针等调节卵巢功能[15-17]。针灸作为中医特色技术,可以疏通气血、调节脏腑及冲任功能,改善机体状态,从而缓解POI患者的相关症状。其中,中国中医科学院针灸医院房繄恭教授经过多年临床淬炼,总结治疗POF的一套行之有效的针刺疗法“调经促孕十三针”[18],以“调冲任,补肝肾,安神志”为原则,选取百会、神庭宁心安神,结合天枢、关元与大赫等穴位调节冲任,外加太溪、肾俞与太冲等穴位调补肝肾,能有效改善患者的临床症状,恢复正常月经周期,改善卵巢反应,从而恢复女性生育能力。临床研究表明[19-21],使用针刺可以降低血清FSH水平,升高血清E2水平,并有利于月经的恢复。本试验结果也显示,针刺可以显著改善POF患者血清FSH、LH、E2以及AMH水平,缓解卵巢早衰患者临床症状和减轻该疾患对患者日常生活的影响程度。

POF患者生殖道菌群与健康受试者相比存在差异[9],POF患者生殖道内新陈代谢紊乱、免疫反应升高,可能是导致生殖道微生物群落出现不平衡、不稳定状态的原因[22]。在调节生殖道菌群方面,本研究中POF患者变形菌门有高于健康受试者的趋势,其中属变形菌门的假单胞菌因其易形成生物被膜,阻碍机体免疫细胞的吞噬以及抗菌药物的作用,导致某些患者体内的病原体无法被完全清除,从而引起生殖道菌群微生态失调[23]。有研究发现放线菌门丰富度偏高与细菌性阴道炎密切相关[24],而针刺可以减少变形菌门、放线菌门的相对丰度,增加拟杆菌门、厚壁菌门的相对丰度,由此,猜测针刺可能通过改善生殖道菌群,调节生殖道免疫功能从而改善卵巢功能。针刺后拟杆菌门丰度增加,可能与针刺调节POF患者多糖、高脂肪和蛋白质的代谢有关,针刺能改善生殖道潜在病原体定植和感染使宿主受益[25]。阴道厚壁菌门以乳杆菌属为主,而乳杆菌作为人体内常见的益生菌,可抑制致病菌生长,从而维持阴道微生态平衡[26]。针刺后,E2水平较治疗前升高,雌激素促进细胞增生和增加糖原的产生[27],糖原可以被阴道内的乳杆菌转化为乳酸,造成了阴道内pH值水平下降,引起微环境的变化,有助于维持阴道的酸性环境。研究发现,奇异菌属、加纳德菌、变形菌为主时宫颈发生病变的风险显著升高[25]。针刺后生殖道变形菌门减少,可说明针刺可调节POF患者生殖道致病菌的产生以及潜在致命毒素的分泌,减少慢性生殖道的感染风险[28]。目前的研究认为,链球菌易在孕期上行进入胎盘后黏附并侵入绒毛膜,引起胎膜早破、早产等并发症的发生[28],加德纳氏菌属易引起阴道黏膜炎症,破坏生殖道屏道环境导致育龄期妇女子宫内膜炎甚至流产[29]。本试验POF患者经针刺治疗后奇异菌属、罗伊氏乳杆菌属均较治疗前增加,双歧杆菌属、加德纳氏菌属和链球菌属较治疗前有下降趋势,说明针刺能一定程度上改善这些菌群所致的不良妊娠结局。

对于物种差异与标志物种分析,发现了健康受试者与POF患者治疗前生殖道菌群的差异菌,这与前期相关课题的研究结论是一致的[9],但针刺前后alpha多样性指数之Shannon指数无统计学意义,一是考虑在临床试验中人体生殖道菌群个体差异较大相关,另一方面可能与本试验针刺干预过程仅3个月,疗程偏短有关,后续研究考虑应延长疗程至半年甚至更长,以期获得更为理想的研究结果。女性生殖道微生物含量低,多样性高,在取材和检验时易受其他菌群污染影响结果。本研究仅仅对生殖道菌群结构进行了初步分析,因针刺前后差异菌群结果不理想,未能进一步做差异菌群对POF的功能预测分析,且未对生殖道分泌物样品行分子水平的检测,期望后续研究能增加检测及分析方法或进行宏基因组测序以进一步验证针刺改善POF的潜在机制。

综上所述,针刺不仅能改善POF的临床症状,而且能下调POF患者促炎菌群变形菌门、放线菌门相对丰度,上调抑炎菌群拟杆菌门、厚壁菌门相对丰度。其机制可能与改变生殖道菌群结构及调节有益菌属而修复生殖道屏障相关,但所发挥的作用机制尚需进一步研究,为针刺治疗POF提供更可靠的理论依据。