棉花现代品种资源产量与纤维品质性状鉴定及分子标记评价

柯会锋 苏红梅 孙正文 谷淇深 杨 君 王国宁 徐东永王洪这 吴立强 张 艳 张桂寅 马峙英 王省芬

1 华北作物改良与调控国家重点实验室 / 河北省作物种质资源实验室 / 华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室 / 河北农业大学, 河北保定 071001; 2 河间市国欣农村技术服务总会, 河北河间 062450

棉花是纺织工业天然原料, 是世界重要经济作物, 对国民经济发展具有重要意义[1]。据国家统计局数据显示, 2014—2019 年以来, 棉花价格走低,植棉效益低, 随之导致植棉面积不断减少, 棉花总产下降, 2020 年, 国际棉花的种植面积和生产总量亦有下降[2]。我国作为棉花的最大进口国, 总产量不足以满足国内市场对棉花的消费需求, 近几年的进口量占国际棉花进口总量的占比高于 20%,2021—2022 年, 我国棉花进口量达218 万吨, 占比达到22%[3]。

随着世界经济的增长和居民消费水平的提升,国际棉花的消费总量呈稳中有增的趋势, 国际棉花市场供需处于紧平衡状态, 且近几年消费量普遍高于生产量, 虽然我国新疆长绒棉属世界顶级, 但整体来看国内棉花的纤维品质参差不齐[4]。而且, 随全球人口持续增长、地球变暖等环境因素导致的生物胁迫和非生物胁迫等问题引发的粮食危机对农作物生产造成很大影响, 加之种植棉花效益低, 使得棉粮争地问题日益突出[5-6]。因此, 培育产量高、纤维长、强度适中、细度好的棉花新品种, 已成为满足市场多样化消费需求、确保国家棉花产业安全以及提高棉农植棉效益有效手段[7]。

棉花育种工作的突破直接取决于优异种质资源的发掘、评价和有效利用, 而种质资源鉴定评价也一直是基础性、连续性和必要性研究工作。近些年来, 随着棉花种植区域调整、气候条件变化、育种目标改变以及新资源、遗传材料不断产生, 急需对这些资源进行系统、精准鉴定, 实现种质资源和遗传育种的相互衔接, 推动种质资源高效利用, 这对于棉花育种、基础研究、种业发展和棉花生产具有重要现实意义。为此, 本研究对课题组收集的来自我国三大棉区(长江流域棉区、黄河流域棉区和西北内陆棉区)的现代棉花品种资源进行产量和纤维品质性状鉴定, 同时结合KASP 和SSR 标记技术对种质资源进行分子水平遗传多样性研究, 旨在明确供试材料遗传特征和遗传多样性, 筛选具有特异性状或综合性状优良的种质资源, 研究结果将为棉花新品种培育提供优良亲本, 为挖掘优异基因提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 供试棉花材料

以课题组收集的来自我国长江流域棉区、黄河流域棉区和西北内陆棉区主要植棉省份近10 余年育成的141 份棉花品种资源为材料, 具体包括黄河流域棉区99 份、长江流域棉区18 份、西北内陆棉区24 份材料(表1)。

表1 供试棉花品种资源及其地理来源Table 1 The upland cotton varieties and their geographic origins in the present study

1.2 试验方法

供试棉花品种资源于2021—2022 年分别种植于河北保定河北农业大学作物育种中心试验基地与海南三亚南滨育种试验基地, 完全随机区组试验设计,行长6 m, 行距0.76 m, 株距0.3 m, 3 次重复, 管理措施与一般大田管理基本相同。

1.2.1 供试棉花品种资源产量性状测定 参照杜雄明等[8]编著的《棉花种质资源描述规范和数据标准》, 在供试材料吐絮期分别收获20 个中部果枝吐絮肥畅的棉铃, 晾干轧花后进行室内考种, 考查项目包括单铃重(boll weight, BW)、子指(seed index,SI)、衣分(lint percentage, LP)和衣指(lint index, LI),其中衣指按照公式LI = (SI×LP)/(1–LP)进行计算。

1.2.2 供试棉花品种资源纤维品质性状测定 每份品种资源分别取15 g 皮棉进行纤维品质测定, 具体包括纤维长度(fiber length, FL)、断裂比强度(fiber strength, FS)、马克隆值(fiber Micronaire value, FM)、整齐度(fiber uniformity, FU)和伸长率(fiber elongation ratio, FE)。首先将皮棉纤维样品放在恒温恒湿(20 ℃ ±2 ℃, RH 65%±3%)实验室平衡48 h, 然后利用HVI1000 纤维品质测定仪进行品质测定, 具体测定交由安徽棉花品质测试中心统一完成。

依据行业标准NY/T1426-2007《棉花纤维品质评价办法》[9]关于优质棉的定义, 将优质棉分为5 档(1A～5A)。

1.2.3 供试棉花品种资源SSR 与KASP 标记检测

首先参照Paterson 等[10]报道的CTAB 方法提取棉花DNA, 紫外分光光度计检测DNA 浓度和纯度(OD260/OD280= 1.8～2.0), 去离子无菌水稀释到15～50 ngL–1, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。随后, 为提高标记检测效率, 本研究利用前人已报道的多态性高、稳定性好的棉花SSR 核心引物[11]以及本课题组筛选的多态性高、稳定性好的SSR 引物, 总共56 对, 对供试品种资源进行标记检测以及遗传多样性分析, 这些SSR 引物位于棉花A 亚组的所有染色体以及D 亚组的3 号、4 号、5 号、7 号、8 号、9 号、10 号、11 号和12 号染色体。

利用课题组前期开发的32 个棉花纤维长度和断裂比强度 KASP 标记对棉花品种资源进行检测(表2), 检测过程于LGC SNPline 384 基因分型检测平台进行, 具体参考课题组报道方法[12]。其中,KASP 检测反应体系为3.04L, 包括1.5L 模板DNA、1.5L 的1×KASP 反应混合液以及0.04L引物混合物。扩增程序为: 94℃预变性15 min; 10 个循环的降落PCR (94℃变性20 s, 61 ℃, 0.6℃降落/循环, 60 s); 26 个循环的扩增(94 ℃ 20 s, 55 ℃ 60 s)。扩增过程在Hydrocycler PCR 仪进行, 扩增结束后,利用StepOne Software version 11.1 进行数据读取和分析。

1.2.4 数据处理方法 利用Microsoft Excel 2010软件计算各性状的平均值、变幅、标准差、变异系数和遗传多样性指数, 其中遗传多样性指数采用Shannon’s 信息多样性指数(H')进行计算,H'= –∑PilnPi,Pi表示不同性状第i级别出现的频率, 根据平均数(X)和标准差()将每个性状分为10 级, 第1 级≤(X–2), 第10 级 > (X+2), 中间每级相差0.5[13]。利用SPSS 25.0 软件进行相关分析, 利用R 语言分析软件进行方差分析, 利用TBtools 软件的平方和欧式距离法对性状进行聚类分析。

依据SSR 扩增产物电泳位置统计条带, 有带记为1, 无带记为0[14]; 所有数据均读取并核对2 遍,确保准确无误。以141 份供试品种资源作为分类单元, 每个SSR 引物作为1 个位点, 每一扩增条带作为1 个性状, 利用NTSYSpc 2.1 软件计算相似系数,采用非加权组算术平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)对相似系数矩阵进行聚类分析, 并计算 Simpson 多样性指数(polymorphic information content, PIC), 其中PIC 值计算公式为

式中,k为SSR 标记检测的等位基因数目,Pi为第i个等位基因变异出现的频率[15]。随后, 根据KASP标记分型结果, 以参考型(Reference)、突变型(Alternate)和杂合型(Heterozygous)为分类单元, 每一类基因型为1 个特点, 相似系数算法同SSR 标记;利用Origin 软件对SSR 和KASP 结果进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 供试棉花产量与纤维品质性状遗传变异及优异种质筛选

2.1.1 供试棉花产量与纤维品质性状遗传变异分析

对供试棉花品种资源2 种环境条件下的4 个产量性状和5 个纤维品质性状进行方差分析发现(表3),产量性状的单铃重、衣分、子指、衣指与品质性状的纤维长度、断裂比强度、马克隆值、伸长率和整齐度在不同棉花品种间的差异均达到极显著水平,说明品种间的产量与纤维品质性状存在真实差异。分析供试棉花品种资源4 个产量和5 个纤维品质性状的遗传变异发现(表3), 单铃重分布在4.78～7.16 g,平均6.03 g, 超过7 g 的大铃材料有3 份, 占比2%;衣分分布在 33.83%～43.30%, 平均 40.18%, 超过42%的材料有24 份, 占比17%; 品种子指在8.40～13.04 g 之间, 差异较大, 平均值为10.38 g。4 个产量性状中, 以衣指的变异系数最大(10.09%), 说明衣指具有较大的育种选择潜力。

表3 供试棉花品种资源产量与纤维品质性状遗传变异Table 3 Genetic variations on yield and fiber quality traits of cotton varieties

供试品种纤维长度分布在25.63～33.92 mm, 变幅为8.29 mm, 平均值为28.18 mm, 有8 份材料纤维长度超过30 mm, 占比6%, 大多数材料纤维长度在26～30 mm, 占供试品种87% (表3), 表明供试品种纤维长度虽能满足纺织工业需求, 但优质长纤维材料较少; 断裂比强度变化范围在 23.43～38.23 cN tex–1, 平均值为28.77 cN tex–1, 有34 份材料高于30 cN tex–1, 占供试品种24%; 马克隆值平均为4.88,最小值为3.72, 最大值为5.95, 其中达到A 级水平(3.5～5.5)的品种有138 份, 占供试品种98%, 达到2A 级水平(3.5～4.9)的有77 份, 占55%, 达到3A 级水平的(3.7～4.2)有8 份, 占6%, 而达到4A 级水平的(3.5～4.2)有6 份, 占比4%。

供试棉花品种资源9 个产量与纤维品质性状的遗传多样性指数, 分布在1.90～2.08 之间, 平均值为2.01 (表3), 表明供试材料遗传多样性较高。基于此,依据品种资源性状表现, 筛选出大铃(> 7 g)种质3份(冀丰1982、衡棉1670 和辽44), 纤维长度和断裂比强度均达到30 的种质6 份(新陆中80 号、鲁棉312、衡无1086、K418、新陆中77 号和新陆中84 号), 高衣分( > 42%)种质24 份(泗棉686、荆棉91、中棉9131和山农圣棉1 号等), 以及2 份同时在多个产量性状与纤维品质性状方面表现较优的种质, 即冀丰1982和衡棉1670 (表4), 这些种质资源可用作棉花育种改良的亲本。

表4 筛选的2 份综合性状优异种质性状表现Table 4 Performances of two screening germplasms with multiple superior traits

2.1.2 不同棉区品种资源产量与纤维品质性状差异分析 供试141 份棉花品种资源分别来自黄河流域棉区、长江流域棉区和西北内陆棉区, 通过分析不同棉区之间品种资源的产量与纤维品质性状, 结果发现(表5), 不同棉区品种性状表现存在较大差异,其中黄河流域棉区的品种表现为单铃重高、子指较大,长江流域棉区的品种资源具有较高的衣分和衣指,而西北内陆棉区的品种则表现为纤维品质性状最优,其纤维长度、断裂比强度、马克隆值、整齐度和伸长率5 个品质性状的平均值均可达到优质棉AA 档水平,但该区品种的单铃重和衣分平均值较低。

表5 不同棉区品种资源产量和纤维品质性状的比较Table 5 Comparison on yield and fiber quality traits of cotton varieties from different geographical origins

2.1.3 供试棉花品种资源产量与纤维品质性状相关分析 对供试棉花品种资源4 个产量性状和5 个纤维品质性状进行相关分析发现(图1), 9 个性状之间存在复杂相关关系, 其中单铃重与子指、马克隆值呈极显著正相关, 与断裂比强度呈极显著负相关;衣分与子指呈极显著负相关, 与断裂比强度呈极显著负相关; 纤维长度与断裂比强度、整齐度、伸长率呈极显著正相关, 与马克隆值呈极显著负相关;断裂比强度与整齐度和伸长率呈极显著正相关, 与马克隆值呈极显著负相关; 整齐度与伸长率呈极显著正相关。可见, 棉花育种中应根据这些性状间的相关性, 充分利用其正相关并加强协调其负相关,才能实现产量与品质性状同步改良。

图1 供试棉花品种资源产量与纤维品质性状相关分析Fig.1 Correlation analysis of yield and fiber quality traits in cotton varieties

2.2 供试品种资源基于表型性状聚类分析

基于9 个产量和纤维品质性状对供试141 份品种资源进行聚类分析发现(表6 和图2), 可将品种划分为2 个类群, 即第I 类和第II 类, 其中第II 类又可分为3 个亚类, 即II-1、II-2 和II-3。进一步分析发现, 每一类群各有特点, 其产量与纤维品质性状存在较大差别, 其中第I 类包含15 个品种, 大多来源西北内陆棉区, 其纤维长度和断裂比强度比较优异, 马克隆值较低, 整齐度和伸长率较高, 单铃重和衣分较低, 属于铃重低、品质较优的材料, 其产量有较大遗传改良潜力。

图2 供试棉花品种资源基于产量与纤维品质性状的聚类图Fig.2 Cluster diagram of cotton varieties based on yield and fiber quality traits

表6 供试棉花品种资源基于表型性状聚类分析Table 6 Cluster result of cotton varieties based on phenotypic differences

第II 类包含126 份品种资源, 其中II-1 包含45个品种, 该亚类品种的单铃重处于中等水平, 衣分较高, 平均值为40.43%, 纤维长度、断裂比强度低于第II 类; II-2 包含22 个品种, 该亚类品种的铃重高, 衣分较高, 平均值为 40.80%, 子指相对较高,但其品质性状较差, 马克隆值高, 可见由于产量与纤维品质性状之间的负相关, 实现协同改良较难;II-3 包含59 个品种, 该类品种整体表现优良, 属于大铃品种, 铃重可达6.18 g, 纤维品质表现较好, 马克隆值也在优质棉范围。

2.3 供试品种资源基于SSR 和KASP 标记遗传多样性分析

2.3.1 基于SSR 标记遗传多样性分析 首先利用冈棉9 号、鲁棉1141、新陆早58 号、冀石265、徐棉608 等8 份地理来源不同且亲缘关系较远的品种资源对56 对SSR 引物进行筛选, 结果获得30 对多态性高、条带清晰、扩增结果稳定且信号强的引物;利用这30 对引物进一步扩增供试141 份品种共扩增出74 个多态性条带(表7), 平均每个引物扩增出2.5个, 以引物H003 多态性最好(6 个多态性条带), 以引物MGH5-6、H098 和H042 多态性条带最少; 引物H010 在源棉41 号和聊棉6 号扩增出特异条带,引物H036、H068、H057 和H010 等在中棉所9001扩增出特异条带; 各引物的PIC 值平均为0.32, 其中PIC 值最高的引物是H057 (0.50), 表明供试棉花品种资源遗传多样性水平较高。

表7 供试棉花品种资源30 对SSR 引物多态性位点及PIC 值Table 7 Polymorphic sites and PIC values of 30 SSR primers in cotton varieties

2.3.2 供试棉花品种资源KASP 标记检测 利用课题组前期开发的32 个棉花纤维长度和断裂比强度KASP 标记, 分别检测供试141 份棉花品种资源(图3), 结果发现, 32 个标记分型成功, 其缺失率平均值为0.03%, 杂合率均小于9%, 具有较好的重复性和稳定性; KASP 标记的多态性信息含量PIC 值均大于0.30, 变幅为0.34～0.80 (表8), 与SSR 标记的PIC 值接近。

图3 供试141 份棉花品种资源基于KASP 标记的荧光检测结果Fig.3 Fluorescence detection results of 141 cotton varieties based on KASP markers

表8 供试棉花品种资源32 个KASP 标记PIC 值Table 8 PIC values of 32 KASP markers in cotton varieties

2.3.3 供试品种资源基于SSR 与KASP 标记聚类分析 基于30 对SSR 标记和32 对KASP 标记检测结果, 计算供试棉花品种资源间的遗传相似系数并进行聚类, 品种间的相似系数分布在0.20～0.98 之间,平均值为0.62。聚类分析发现(图4), 141 份棉花品种资源可分为2 类, 其中第I 类包含28 个品种, 第II类包含113 个品种, 并且第II 类又可分为3 个亚类即II-1、II-2 和II-3, 分别含38 份、36 份和39 份品种。进一步分析不同类别棉花品种资源的产量与纤维品质性状发现, 第I 类属于综合性状表现最优的一类, 其铃重高、衣分高、纤维品质优, 多数来自辽宁和新疆地区, 与前述表型性状聚类分析的第I 类相比, 这一类表现都较优, 且辽棉27 号、新陆中73号、新陆中80 号、新陆中83 号、源棉11 号被聚到相同类群, 说明其亲缘关系较近。同时发现, 第II-1类包括冈棉9 号、冀棉616、金农16、冀石33 和衡无1086 等38 份品种, 其中有19 份与表型聚类结果一致; 第II-2 类包含冈棉10 号、冈棉11 号、鲁棉1141 和山农棉14 号等36 份品种, 其中17 份材料与表型聚类结果一致; 第 II-3 类包括荆棉 91、湘XH50、创棉11 号和湘FZ031 等39 份品种, 该类品种来源较广, 在第II 类中表现最优, 其表型基本达到第I 类的优异水平。

图4 供试141 份棉花品种资源基于SSR 与KASP 标记的聚类图Fig.4 Dendrogram of the 141 cotton varieties based on SSR and KASP markers

综合分析表型聚类和分子标记聚类结果, 品种冈棉9 号、中棉所117 和冀丰1271 等材料在表型性状聚类和分子标记聚类结果一致, 部分西北棉区的材料也被聚为一类, 如新陆中80 号、新陆中73 号和源棉11 等聚类结果一致; 但也有一部分材料在2种聚类结果中的差别较大, 如新陆中54 号、辽棉31、辽棉34 和新陆中76 号等在分子标记聚类中属于相同类别, 而在表型聚类中属于不同类群。

3 讨论

高产、优质一直是棉花育种改良的重要目标性状, 系统了解种质资源的产量和纤维品质性状对于棉花育种尤为重要。刘文欣[16]分析我国不同棉区品种改良效果发现, 与早期品种相比, 黄河流域棉区近期育成品种的产量、单株铃数和衣分分别提高28.6%、27.0%和 7.4%, 长江流域棉区分别提高24.3%、19.1%和7.5%, 新疆棉区分别提高39.4%、27.0%和12.6%, 育种改良效果显著。本研究以来自我国三大棉区的141 份近期育成品种为材料, 通过鉴定其4 个产量和5 个纤维品质性状, 结果发现, 三大棉区新近育成品种存在一定差别, 其中黄河流域棉区品种的单铃重高于长江流域和西北内陆棉区品种, 而西北内陆棉区品种的纤维品质性状最优, 但其衣分却低于长江流域和黄河流域棉区品种, 说明其进一步改良的空间较大, 这一结果与刘文欣[16]和代攀虹等[17]的结果较吻合。然而, 在西北内陆棉区,棉花品种的铃重进一步提高存在一定困难, 原因在于棉铃过大通常会影响纤维成熟度, 不利于提高纤维品质。因此, 西北内陆棉区品种产量的提高应以增加单株铃数和衣分为主, 同时重视纤维品质各主要指标之间的协调, 综合考虑品质与产量以及早熟性间的关系。

并且, 本研究通过分析供试棉花2 类性状(产量性状与纤维品质性状)间的相关性发现, 2 类性状间存在复杂的相关关系, 比如单铃重与比强度之间、衣分与纤维长度之间、衣指与比强度之间均存在显著负相关, 而单铃重与马克隆值之间、衣指与马克隆值之间则存在显著正相关。同时发现, 每类性状内亦存在复杂的相关性, 比如产量性状的单铃重与子指之间、单铃重与衣指之间、衣分与衣指之间均存在显著正相关, 而衣分与子指之间则存在显著负相关; 品质性状的纤维长度与比强度之间、比强度与整齐度之间、整齐度与伸长率之间存在显著正相关, 而比强度与马克隆值之间、纤维长度与马克隆值之间则存在显著负相关。由此可见, 若想选育出既高产又优质的棉花新品种, 必须充分考虑上述性状间的复杂关系, 并且仅仅依靠表型鉴定与选择很难实现, 需要依赖分子标记以及分子育种手段, 寻找产量与品质性状“双赢QTL”, 进而实现产量与品质性状协同改良。

特色优异种质资源是育种工作的基础。江西省棉花研究所[18]将抗草甘膦基因转入优异种质, 通过杂交回交等育种手段培育出一批抗草甘膦、高产、优质棉花新品种。王国宁等[19]利用转iaaM株系为父本与综合性状优良棉花品系进行杂交、回交, 获得6份衣分高于43%、马克隆值在优质棉中处于AAA 级,早熟性好、铃大且抗性好的优良品系。张安红等[20]将抗虫基因Vip3A转化优异种质冀合713, 创制出抗虫转基因棉花新材料。近些年来, 我国棉花育种工作者育成了一系列早熟、抗病、优质、高产新品种,这些新品种在生产中发挥了重要作用。因此, 将这些品种在相同环境下进行精准鉴定, 并通过分子标记技术分析其遗传多样性, 对于发挥品种育种价值具有重要意义。为此, 本研究对141 份近期选育棉花品种资源, 在2 种环境下鉴定其4 个产量性状和5个纤维品质性状, 并结合SSR 和KASP 标记遗传多样性分析, 明确了品种资源的特征和多样性水平,为其进一步利用提供了依据; 本研究基于各品种资源性状表现筛选出大铃种质3 份, 高衣分种质24 份,纤维长度和断裂比强度均达到30 的种质6 份, 综合性状表现优异的种质2 份, 这些种质资源在今后育种工作中可作为亲本加以利用。

此外, 表型鉴定和分子标记相结合用于种质资源遗传多样性分析对于资源利用非常重要。表型鉴定的优势在于能够直观反映种质资源性状表现, 但其鉴定过程耗时长、成本高、耗费人力且易受环境因素影响, 比如本研究通过比较2 种环境下的供试棉花品种资源产量与品质性状差异发现, 与保定环境条件下种植的品种相比, 海南环境条件下种植的品种的单铃重、子指、马克隆值、纤维长度和强度均呈现下降趋势, 而衣分呈现升高趋势, 可能与两地气候条件差异有关。与表型鉴定不同, 分子标记鉴定不受环境条件的影响, 可实现种质资源快速鉴定, 但其鉴定结果无法反映品种真实表现[21]。因此,结合使用2 种方法就可以达到优势互补, 实现资源高效准确利用。为此, 本研究结合利用表型鉴定和分子标记鉴定2 种方法对来自我国三大棉区的141份近期选育棉花品种资源进行鉴定, 既明确了这些品种资源的主要产量和纤维品质性状遗传变异, 又掌握了这些品种资源DNA 水平的遗传多样性, 对进一步利用品种资源开展常规育种和分子育种具有重要意义。另外, 通过比较表型鉴定和分子标记鉴定获得的聚类结果发现, 有些品种的聚类结果一致,但也有一些材料在2 种聚类中的结果存在较大差别,分析原因一方面与2 种聚类分析所反映的性状或位点不同, 另一方面也可能与标记聚类所用KASP 标记均为纤维长度和断裂比强度关联分子标记有关。

4 结论

本研究明确了141 份现代棉花品种资源的产量和纤维品质性状遗传变异, 发现供试品种资源在表型性状和分子水平均存在较丰富的遗传多样性, 筛选出3 份大铃品种、24 份高衣分(>42%)品种, 6 份纤维长度、断裂比强度均大于30 的品种和2 份综合性状表现优异的品种, 为棉花新品种培育提供了优异亲本, 为深入利用这些品种资源提供了依据。