GO-CeO2 防污剂的制备及性能研究

熊汉桢，贺小燕，楼 彤，白秀琴

(1.湖北隆中实验室，湖北 襄阳 441000；2.武汉理工大学a.船海与能源动力工程学院，b.水路交通控制全国重点实验室，湖北 武汉 430063)

0 前 言

菌类、藻类等污损生物极易在船舶等海洋装备表面附着，发生海洋生物污损[1]。以海船为例，生物污损形成后，船体表面形貌被破坏，航行阻力增加，能耗加剧[2]。目前已有多种技术手段规避生物污损，其中，采用防污涂层来减少或者抑制污损生物的附着是应用最广泛的防污手段。传统的防污涂层将其负载的防污剂如三丁基锡(TBT)[3]、氧化亚铜(Cu2O)[4]等化学防污剂溶解渗出至海洋环境中，通过改变表面的附着环境或杀死污损生物，达到防污目的。但这类防污剂会影响海洋生态环境而受到使用限制[5]。因此，寻找绿色高效的新型防污剂至关重要。

卤代过氧化物酶[6]是生物酶的一种，对海洋污损生物具有极强抑制能力，被作为防污剂[7]与商业涂料共混，构筑了性能优异的防污涂层[8]。但本质属于蛋白质的天然卤代过氧化物酶的稳定性差，在pH 值和温度等因素剧烈变化下很容易失活[9]，限制了其在防污领域的应用。V2O5和稀土CeO2纳米颗粒(CeO2NPs)可以模拟天然卤代过氧化物酶，作为防污剂制备的涂层都可在海洋防污测试中坚持50 d 以上，并且效果优于其他涂层[10]。但是V2O5纳米材料具有致癌性，而CeO2NPs 无毒，不会破坏海洋非目标生物，也不会破坏海洋生物链，有利于保护海洋生态环境。CeO2纳米颗粒中的Ce3+位点在微量H2O2存在下，会催化Br-形成卤化物[11](如HOBr)，形成的HOBr 能灭杀污损生物[12]或干扰污损生物群体感应信号[13]，抑制生物膜的形成，在初始阶段抑制生物污损发生[14]。He 等[11]报道通过水热法合成不同纵横比的CeO2纳米粒子对革兰氏阴性杆菌大肠杆菌(E.coli)具有显著抗菌作用。

但是，纳米CeO2为降低其表面能会自发团聚，导致反应面积减少[15]，Ce3+位点也相应减少，其卤代过氧化物类酶活性有很大的提升空间。目前，已有利用碳材料提高CeO2类酶活性。Wang 等[16]通过共沉淀法合成CeO2＠C 核壳结构，作为一种有效的卤代过氧化物酶模拟物，对大肠杆菌(革兰氏阴性)、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和铜绿假单胞菌等典型的海洋生物表现出优秀的防污性能。在众多的碳材料当中，二维蜂窝状碳材料氧化石墨烯(GO)由于其表面含氧官能团的存在和π-π 键的堆积作用，为GO 与纳米晶体提供了优良结合位点。除此也有利用GO 负载其他纳米颗粒的报道，Liu 等[17]通过简单的热还原法将GO 与银纳米颗粒合成AgPNs＠ rGO，进而制备双功能硅酸盐涂层，防止铜管腐蚀和污损结垢。不过，利用GO负载CeO2以提高其卤代过氧化物类酶活性的相关报道较少。

本工作利用传统水热反应制备GO 负载CeO2复合材料(GO-CeO2)，研究所制备材料的形貌特征、物相成分、表面Ce3+位点浓度等物理化学特性，并利用酚红溴化反应对GO-CeO2样品进行卤代过氧化物类酶活性分析，系统地研究不同GO 含量的GO-CeO2的抗菌防污性能。可以预期，GO 的负载增强了CeO2的卤代过氧化物酶活性，从而提升了其抗菌防污的性能，为绿色防污领域提供新思路，同时为CeO2的类酶活性进行海洋防污奠定理论基础。

1 材料制备及性能表征

1.1 材 料

六水合硝酸铈(Ce(NO3)3·6H2O，99.5%)、单层氧化石墨烯分散液(Graphene Oxide，GO，2 mg/mL)、苯酚红(Phenol red，C19H14O5S，AR)购自上海麦克林生化科技有限公司(中国)，氢氧化钠(NaOH，AR)、30%过氧化氢(30%H2O2)、无水乙醇(C2H5OH，AR)购自国药化学试剂有限公司，市售氧化铈(CeO2，99.5%)、溴化铵(NH4Br，99.9%)购自上海阿拉丁实业公司(中国)，Luria-Bertani(LB)琼脂固体培养基，LB 液体培养基购自山东青岛希望生物科技有限公司。

1.2 GO-CeO2样品的制备

选取质量分数分别为1%，2%，4%的GO 为Ce(NO3)3·6H2O 与NaOH 的反应产物CeO2的晶核生长提供负载层，采用水热法制备不同GO 质量分数的GO- CeO2复合材料(分别记为1%GO - CeO2，2%GO-CeO2，4%GO-CeO2)，合成过程见图1。样品1%GO-CeO2的制备过程为:(1)量取1.87 mL GO 溶液加入33.13 mL 去离子水中，超声振荡1 h；(2)称量868 mg Ce(NO3)3·6H2O 溶解于5.00 mL 去离子水中，并放置于离心管；(3)超声完成后将Ce(NO3)3·6H2O 溶液和1 600 mg NaOH 先后倒入GO 溶液中，室温下搅拌30 min；(4)溶液转移至高温反应釜(100 ℃，24 h)；(5)离心后真空干燥(60 ℃，24 h)获得1%GO-CeO2样品。

图1 GO-CeO2合成示意Fig.1 Schematic diagram of GO-CeO2 synthesis

2%和4%GO-CeO2复合材料的制备工艺与1%GOCeO2复合材料的相同，但2%GO-CeO2复合材料制备中GO 溶液体积为3.75 mL，去离子水为31.25 mL；4%GOCeO2复合材料制备中GO 溶液体积为7.50 mL，去离子水为27.50 mL。

1.3 GO-CeO2的物理化学性质表征

利用透射电子显微镜(TEM，JEM-2100)观察GOCeO2中CeO2的分布，并确定晶粒特征。利用场发射扫描电子显微镜(FESEM，SIRION)观察样品的表面形貌，附带的能谱仪(EDS，Energy-dispersive X-ray Spectrometer)用于分析材料的元素成分。X 射线衍射仪(XRD，Empyrean)用于样品的物相鉴定。X 射线光电子能谱仪(XPS，ESCALAB 250Xi)以铝靶(Al -Kα，1 486.6 eV)作为辐射源，用于分析计算GO-CeO2中Ce4+和Ce3+位点浓度。紫外-可见分光光度计(UVVis，Lambda 750S)用于获得紫外-可见反射光谱，光谱范围为300～800 nm。

1.4 类酶活性分析

通过Hu 等[18]报道的方法分析GO-CeO2样品模拟卤代过氧化物酶活性的能力。GO-CeO2样品通过重力沉降固定在面积为1 cm×1 cm 的比色皿底部。其中，含有1.0×10-2mol/L GO-CeO2样品、2.8×10-5mol/L 酚红、4.4×10-3mol/L NH4Br 和4.2×10-4mol/L H2O2。30%H2O2溶液不稳定、易分解，因此在每次测试前加入。酚红溴化过程中，比色皿最终体积为3 mL。通过UV-Vis 在432 nm 处以30 min 的固定时间间隔记录数据，持续时间为90 min；之后以10 min 的固定时间间隔记录数据，总持续时间为420 min。最后通过对数据的催化动力学分析比较复合材料的卤代过氧化物类酶活性。

1.5 GO-CeO2的抗菌性能

革兰氏阴性杆菌大肠杆菌(E.coli)用于测试样品的抗菌性能(ATCC 25922)。E.coli 在LB 琼脂固体培养基中孵育，待菌落发育完全，选取单个菌落移至LB液体培养基，37 ℃，120 r/min 培养24 h。随后用质量分数为0.9%的生理盐水离心菌液3 次，再用生理盐水重悬菌液[11]。为研究GO-CeO2的抗菌性能，模拟海洋环境，将重悬菌液浓度稀释至106/mL。然后进行重量配比，使生理盐水悬浮液中含有5.0×10-4mol/L 样品(1%GO-CeO2、2%GO-CeO2、4%GO-CeO2，市售CeO2作为对比)、1.0×10-3mol/L NH4Br、2.5×10-7mol/L H2O2，最终体积为50 mL。之后继续保持E.coli 孵育在该混合溶液中(37℃，120 r/min)。4 h 后，梯度稀释(100、10-1、10-2和10-3)菌液。用Tesler 等[19]报告的方法，每个时间间隔重复涂布于营养琼脂平板，通过计算样品的抗菌效率，分析GO-CeO2的抗菌性能。

2 结果与讨论

2.1 GO 负载CeO2的形貌特征

利用水热法合成了不同含量GO 负载CeO2复合材料，图2 是其透射电镜形貌。从图2 可以看出，CeO2已成功负载于GO，不同的复合材料呈现不同形貌:长棒(少)+短棒(多)型的1%GO-CeO2复合材料；短棒型的2%GO-CeO2复合材料；长棒(多)+短棒(少)型的4%GO-CeO2复合材料。水热反应中，Ce(NO3)3·6H2O 中Ce3+与OH-结合产生不稳定前驱体Ce(OH)3，当OH-浓度高时，Ce3+更容易转化为Ce4+[11]，Ce4+更倾向与OH-结合。奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald ripening)[20]参与CeO2晶核生长过程，该自发过程诱导晶核溶解-重结晶，产生棒型不同的CeO2纳米颗粒。1%GO-CeO2的高分辨透射电镜形貌(HR-TEM)表明，晶格条纹间距2.71×10-4μm 对应CeO2的(200)面(图2b1)。2%GOCeO2的HR-TEM 显示晶格条纹间距为3.12×10-4μm，对应CeO2的(111)面(图2b2)。4%GO-CeO2的HRTEM 显示的晶格条纹间距中3.12×10-4μm 和2.71×10-4μm 分别对应CeO2(111)面和(200)面排列，并且可以分析出特定角度的CeO2棒型晶面分布(图2b3)。CeO2晶体负载在GO 上，不过不同GO 负载条件下，3者CeO2的棒型和空间利用率各有差异。其中，2%GOCeO2短棒型CeO2分布均一，反应面积最大，这可能为CeO2发挥类酶活性创造更好的反应条件。

图2 不同含量GO 负载CeO2 复合材料的透射电镜形貌和高分辨透射电镜形貌Fig.2 TEM images and high-resolution TEM images of different content of GO loaded with CeO2 composite materials

2.2 成分、结构及表面Ce3+位点浓度

图3 为GO-CeO2的EDS 能谱和XRD 谱。

图3 GO-CeO2 EDS 谱和XRD 谱Fig.3 EDS patterns and XRD patterns of GO-CeO2

从图3a 可知GO-CeO2具有明显的C 峰，O 峰和Ce峰。从图3b 可看出明显的CeO2特征峰(JCPDS 43-1002)，主要2θ值为28.55°，33.08°，47.47°，56.33°，对应晶格的晶面从左往右依次是(111)，(200)，(220)，(311)。

图4 为GO-CeO2的XPS 全谱。从图4 可知，所有的样品都存在C、O、Ce 元素。1%GO-CeO2，2%GOCeO2，4%GO-CeO2的元素含量见表1。

表1 GO-CeO2中C，O，Ce 的原子分数 %Table 1 Atomic fraction of C，O，Ce in GO-CeO2 %

图4 GO-CeO2 XPS 谱Fig.4 XPS spectra of GO-CeO2

图5 为GO-CeO2的C，O，Ce XPS 精细谱。

图5 1%GO-CeO2，2%GO-CeO2，4%GO-CeO2XPS 的C，O，Ce 精细谱Fig.5 C，O，Ce fine spectra of 1%GO-CeO2，2%GO-CeO2，4%GO-CeO2

从图5 可知，C 精细谱(图5a)的峰分峰后归属于C-C(284.8 eV)，C-O(286.2 eV)，C ＝O(288.4 eV)，COOH/COOR(289.8 eV)，π-π*(291.6 eV)[21，22]，含氧官能团和π-π*键证实了GO-CeO2中GO 的存在。GO-CeO2中Ce 精细谱(图5c)中，v0(883.0 eV)[11]，v′(888.3 eV)[23]，u0(901.3 eV)，u′(907.1 eV)[24]峰归属于Ce3+价态，v(885.1 eV)[25]，v′′(890.8 eV)，v′′′(899.2 eV)[26]，u(903.2 eV)[25]，u′′(909.7 eV)，u′′′(917.9 eV)[27]归属于Ce4+价态。进一步利用公式(1)和(2)计算Ce3+和Ce4+位点浓度:

式中，Ay是峰“y”的积分面积(y指代v0、v、v′、v′′、v′′′、u0、u、u′、u′′、u′′′)，如图5a 所示。由公式(1)和(2)计算出的3 种GO-CeO2中Ce3+、Ce4+的含量(见表2)可知，2%GO-CeO2中Ce3+浓度最高，达到38.08%。GO-CeO2中Ce 元素存在3 价和4 价，氧化物为保持电中性，一些晶格氧会从萤石结构逃逸。O 精细谱中5 个峰(图5b)归属于晶格氧OA(529.6 eV)[28]，缺陷/吸附氧OB(530.2 eV)[29]，O ＝C(531.2 eV)，O-C(532.5 eV)[21]，羟基水/碳酸盐(534.4 eV)[30]。由CeO2化学式可知Ce与O 的比值应为1 ∶2，由表2 中OA与OB浓度计算对比后发现达不到该结果，因此证实了CeO2中氧空位的存在，进一步证实Ce3+浓度与CeO2中氧空位浓度相关。

表2 GO-CeO2中Ce3+，Ce4+，OA，OB含量 %Table 2 Ce3+，Ce4+，OA，OB content in GO-CeO2 %

GO -CeO2吸附边缘表明其具有不同能带间隙(Eg)。利用吸收系数和能带间隙的函数关系计算Eg估计值:

式中，CeO2处于直接跃迁状态，n为2，A是常数，α是光吸收系数，hυ是光子能量。图6 为GO-CeO2的紫外-可见吸收光谱和能带间隙。从图6b 可知，Eg分别为2.86 eV(1%GO-CeO2)，2.76 eV(2%GO-CeO2)，2.91 eV(4%GO-CeO2)，均小于块状CeO2的3.19 eV[31]。CeO2晶格中氧空位的存在造成能带间隙降低，表示GO-CeO2具有氧空位和Ce3+缺陷，与XPS 分析结果相互印证。除此，2%GO-CeO2还具有最多的Ce3+缺陷。CeO2缺陷对其卤代过氧化物酶活性有积极影响[11]，预估2%GO-CeO2卤代过氧化物的类酶活性最强。

图6 GO-CeO2的紫外-可见吸收光谱和能带间隙Fig.6 UV-Vis Spectra and Eg of GO-CeO2

2.3 类酶活性

波长于432 nm 处，UV-Vis 检测酚红消耗的光密度(optical density，简称od)值变化如图7 所示。

图7 GO-CeO2酚红随时间的变化值(1.0×10-2 mol/L GO-CeO2、2.8×10-5 mol/L 酚红、4.4×10-3 mol/L NH4Br 和4.2×10-4 mol/L H2O2在3 mL 比色皿中)Fig.7 Changes of phenol red in GO-CeO2 with time(1.0×10-2 mol/L GO-CeO2，2.8×10-5 mol/L phenol red，4.4×10-3 mol/L NH4Br and 4.2×10-4 mol/L H2O2 in 3 mL cuvette)

GO-CeO2在溴源(NH4Br)和H2O2存在情况下模拟卤代过氧化物酶，会发生溴化反应，该反应消耗酚红。毋庸置疑，GO-CeO2样品中不仅CeO2溴化反应消耗酚红，而且GO 的染料吸附同样消耗酚红。将100 min 前3 种GO-CeO2的斜率和速率分别命名为K1%GO-CeO2、K2%GO-CeO2、K4%GO-CeO2、v1%GO-CeO2、v2%GO-CeO2、v4%GO-CeO2。根据GO-CeO2制备步骤中的数量关系，不同GO-CeO2中GO 用量比值为1 ∶2 ∶4。假设一份GO 对酚红的吸附速率为vGO，斜率为KGO，不同GO-CeO2中CeO2消耗酚红的斜率与速率分别是K1，K2，K4，v1，v2，v4。斜率代表单位时间内的od 值变化趋势。可得:

由图7 知，公式(4)～(6)中数值K皆小于0。以上对应速率关系为:

公式(7)～(9)中数值v皆大于0。对前100 min进行曲线拟合，得到相关参数(表3)。

表3 GO-CeO2相关拟合曲线参数Table 3 Correlation fitting curve parameters in GO-CeO2

公式(5)减去2 倍的公式(4)得:

因此

公式(6)减去2 倍的公式(5)得

因此

综合公式(10)～(13)推理得到

由斜率推测出速率对比

公式(15)证实GO-CeO2中CeO2消耗酚红的速率1%GO-CeO2略高于2%GO-CeO2的，远高于4%GOCeO2的。之前的成分分析表明，2%GO-CeO2具有最多Ce3+和氧空位，结合标准误差，可推导2%GO-CeO2的消耗酚红速率最大，其卤代过氧化物类酶活性最大，即抗菌防污性能最强；1%GO - CeO2的类酶活性接近于2%GO-CeO2的。

2.4 抗菌防污性能

在混合有5.0×10-4mol/L GO - CeO2、1.0×10-3mol/L NH4Br、2.5×10-7mol/L H2O2的50 mL (106/mL)E.coli 生理盐水悬浮液中，取4 h 后细菌悬浮液，进行抗菌性能分析，其结果见图8，没有添加GO-CeO2样品，并且其他条件与实验组一致的细菌数目为空白对照组(Control)。从图8 可以看出，Control 组，市售CeO2组，GO 组，1%GO-CeO2组，2%GO-CeO2组，4%GOCeO2组的细菌数目取均值后分别为9.47×104，8.50×103，6.50×103，3.55×103，1.45×103，4×103cfu/mL(图8a)。以空白组数据为基准，市售CeO2组，GO 组，1%GO-CeO2组，2%GO-CeO2组，4%GO-CeO2组的细菌抑制率分别为91.02%，93.13%，96.25%，98.47%，95.60%(图8b)。GO 本身具有防污能力，微生物与GO持续接触会导致细胞膜完整性破坏以及细胞成分氧化[32]，GO 可杀死93.13%的细菌。虽然GO 的抗菌性达到93.13%，但是该结果下的 GO 用量远远多于GO-CeO2。GO 的负载优化了CeO2的卤代过氧化物类酶活性，进而提高了其抗菌防污性能。2%GO-CeO2的细菌抑制率在其基础上进一步提高至98.47%。

图8 5.0×10-4 M GO、市售CeO2，GO-CeO2的50 mL细菌生理盐水悬浊液(1.0×10-3 mol/L NH4Br，2.5×10-7 mol/L H2O2)4 h 后的cfu 和抑菌率Fig.8 Cfu and antibacterial rate of 5.0×10-4 mol/L GO，commercially available CeO2，GO-CeO2 in 50 mL bacterial saline suspension(1.0×10-3 mol/L NH4Br，2.5×10-7 mol/L H2O2) after 4 h

在一定条件下GO-CeO2中Ce3+位点和Ce4+位点会互相转化。Ce 原子直接与碳纳米管中的碳原子配位[33]，推测GO 中的碳原子也与CeO2中Ce 配位。Ce3+位点在H2O2存在情况下，会与H2O2键合。这种状态不稳定，产生羟基自由基(OH·)和氢氧根离子(OH-)的同时Ce3+位点转化为Ce4+位点。因为OH·与溴离子(Br-)反应生成溴自由基(Br·)与OH-，而OH-质子化生成H2O。次溴酸(HOBr)破坏细胞壁，产生的孔洞致使细菌内容物泄露而死亡[34]；还干扰污损生物群体感应信号[13]，抑制生物膜形成。在H2O2与溴源(Br-)同时具备条件下，HOBr 持续扩散，发挥稳定高效的抗菌作用。

以GO 作为负载层促进GO-CeO2卤代过氧化物类酶活性。2%GO-CeO2表现出高卤代过氧化物类酶活性，具有最好的抗菌效果，为制备新型防污剂提供了新思路。综上，本工作阐明了GO-CeO2复合材料的形貌，卤代过氧化物类酶活性以及防污性能之间的关系，证明通过水热法将CeO2负载到GO 来提高绿色防污性能的可行性。

3 结 论

(1)为提高纳米CeO2的抗菌效率，以GO 为负载层，为CeO2晶核创造更好的生长条件，成功地制备了3种不同浓度GO 负载的纳米CeO2颗粒样品(1%GOCeO2、2%GO-CeO2和4%GO-CeO2)。

(2)相关测试结果表明，2%GO-CeO2中短棒型CeO2分布均一，Ce3+浓度最高，其带隙能量最小为2.76 eV，具有高效卤代过氧化物类酶活性，对大肠杆菌的抑菌率为98.47%，具有优异的抗菌性能。

(3)与商品化的CeO2相比，GO-CeO2复合材料具有更强的卤代过氧化物类酶活性，为CeO2绿色高效新型防污剂的应用提供了新参考，同时为利用CeO2的类酶活性进行海洋防污奠定了理论基础。