基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的江西特产中药茶芎化学成分研究

郑 鹏,黄 敏,张金莲*,郑郁清,商 杰,郭静英,刘明贵,徐葱茏

1江西中医药大学药学院,南昌 330004;2江西景德中药股份有限公司,景德镇 333302

茶芎来源于伞形科藁本属植物茶芎(LigusticumsinenseOliv.cv.Chaxiong Mss.)的干燥根茎,其性温,味辛,归肝、心经,具有活血行气、祛风止痛的功效[1]。近年来,研究发现茶芎还具有抗炎、镇痛、抗血栓形成、促进血管扩张等作用[2],在放射性口腔炎[3]、脑卒中[4]、血栓性疾病[5]、新型冠状病毒肺炎[6]等方面有一定的治疗效果。茶芎是江西省特产中药材之一,主要产于九江地区的武宁、瑞昌、德安等县市,是当地重要的中药资源和经济作物。茶芎药用历史悠久,古代称为“抚芎”,与川芎等合称为“芎穹”,最早见于《神农本草经》,列为上品[7]。宋代以后,“抚芎”名称出现分化[8],清代《本草纲目拾遗》[9]、《本经逢原》[10]和《得配本草》[11]等著作均有记载,现收载于2014年版《江西省中药材标准》。

目前关于茶芎化学成分的研究报道较少,现有的文献主要涉及苯酞类、有机酚酸类、生物碱类和多糖等化学成分的分离鉴定,但这些研究周期长、效率低,且多数文献年代较早,缺乏全面性和创新性。为了提高茶芎化学成分的分离效率和纯度,Gong等[12]采用高效液相色谱(HPLC)法建立了茶芎的指纹图谱,并指认和测定了其主要成分如绿原酸和阿魏酸等。然而,相关药理研究多以粗提物为对象,对于茶芎的药效物质基础和作用机制还不够深入探讨,导致茶芎的临床应用受到限制。因此,明确茶芎的物质基础对于开展相关的药效学研究、进一步应用和开发茶芎有着重要意义。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)分析技术具有快速、高效、灵敏度高等特点,能够实现对化合物的快速分离和精确鉴定,在中药研究方面已经得到广泛应用[13]。前人研究发现,在正离子模式下苯酞类成分、氨基酸类成分和生物碱类成分响应较强[14],而在负离子模式下有机酚酸类成分响应程度更好[15]。因此,本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,同时采用正离子和负离子两种离子化模式检测,对茶芎化学成分进行快速分析,进一步明确了茶芎中苯酞类、有机酚酸类、生物碱类等多种化学成分的构成,为茶芎的质量控制及药效物质基础研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂

茶芎采收于江西省武宁县,经江西中医药大学张寿文教授鉴定为伞形科植物茶芎(LigusticumsinenseOliv.cv.Chaxiong Mss.)的干燥根茎;色谱级甲酸(批号:73C1812PR),色谱级乙腈(批号:302Y1906HB),均购于美国ACS公司;屈臣氏饮用水(广州屈臣氏食品饮料有限公司);其余试剂为分析纯。

1.2 仪器

Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪,配备ESI离子源及Anaiyst 1.6数据处理软件;Peak View数据处理软件(美国AB SCIEX公司)。

1.3 供试品溶液制备

取茶芎粉末(过四号筛)约0.8 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入80%甲醇10 mL,密塞,称定重量,超声25 min,放冷,称定重量,用80%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,13 000 r/min离心10 min,取上清液,过0.22 μm微孔滤膜,即得。

1.4 色谱条件

采用Titank C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色谱柱,以乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～10 min,5%→50% A;10～18 min,50%→55% A;18～30 min,55%→65% A;30～40 min,65%→95% A;40～42 min,95% A;42～42.1 min,95%→5% A;42.1～45 min,5% A),柱温40 ℃,流速0.25 mL/min,进样量3 μL。

1.5 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI),正、负离子检测模式。扫描方式为全扫描,质量扫描范围m/z50～1 000;喷雾电压(ISVF)5 500 kV;离子源温度(TEM)500 ℃;去簇电压(DP)100 V;碰撞能量(CE)35 eV,碰撞能量叠加(CES)35±15 eV;气帘气压力(CUR)40 kPa;雾化器GS1和辅助气GS2压力为50 kPa;数据采集时间46 min。

1.6 数据处理

数据采集软件:Analyst 1.6;数据分析软件:Peakview 1.2。通过CNKI、SciFinder、Geenmedical、TCMSP、PubMed等平台及数据库,查阅相关文献,收集茶芎以及藁本属植物报道的化合物信息,汇总后删除重复的成分,建立成分的一级质谱数据库,其中包含化合物名称、分子式、分子量等基本信息。将液质联用仪采集的数据导入 Peakview 1.2软件中,利用XIC Manager插件进行无目标筛查,对筛查出的化合物进行碎片离子比对,结合色谱保留时间、精确分子质量、特征碎片离子、MS/MS裂解规律和文献报道等指征茶芎的化学成分。

2 结果

通过UPLC-Q-TOF-MS对茶芎的化学成分进行分析,得到正离子和负离子模式的质谱总离子流图见图1。根据“1.6”项下数据分析方法,结合文献报道,从茶芎中共鉴定出72个化合物,其中苯酞类化合物33个,有机酸类成分32个,生物碱类成分5个,其他类成分2个,结果见表1。

表1 茶芎化学成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

图1 茶芎正离子(A)和负离子(B)模式总离子流图

2.1 苯酞类

苯酞类成分是从茶芎中鉴定得到数量最多的成分,也是最主要的药效成分。其主要包括简单苯酞类和苯酞二聚体类两种类型。

2.1.1 简单苯酞类

简单苯酞类化合物裂解方式主要有2种,一种是苯酞类化合物侧链断裂脱烯(CnH2n)产生[M-CnH2n+H]+碎片,另一种是苯酞内酯环开环脱水再脱羰基,产生[M+H-H2O]+、[M+H-H2O-CO]+碎片。本研究从茶芎中鉴别出的简单苯酞类成分21个,包括化合物30～33、37～40、44～47、49、50～54、56、58、59。以化合物50为例进行解析,化合物50的准分子离子峰为m/z193.123 2[M+H]+,根据元素组成分析,判断该化合物的分子式为C12H16O2,其裂解方式主要有2种。其一,苯酞类化合物侧链断裂失去一分子C4H8得到碎片离子m/z137.059 8[M+H-C4H8]-;其二,苯酞内酯环开环脱去一分子H2O得到碎片离子m/z175.112 3[M+H-H2O]-,继续脱去一分子CO得到碎片离子m/z147.116 7[M+H-H2O-CO]-,继而脱去一分子C3H6得到碎片离子m/z105.069 1[M+H-H2O-CO-C3H6]-(见图2),与文献[13,14]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物50为洋川芎内酯A。

图2 洋川芎内酯A可能的质谱裂解途径

2.1.2 苯酞二聚体类

苯酞二聚体类化合物是一类由2个苯酞单体聚合物形成的化合物,在高能量撞击下易开环,形成苯酞单体碎片离子,在此基础上产生与上述单体相同的特征裂解碎片。本研究从茶芎中鉴别出苯酞二聚体类化合物12个,包括化合物55、57、60～69。化合物61在正离子模式下得到m/z381.206 0的分子离子峰,分析确定化合物分子式为C24H28O4,在高能量轰击下开环,形成m/z191.107 1[M/2+H]+苯酞单体碎片离子,在此基础上脱去一分子C2H4产生碎片m/z163.111 8[M/2+H-C2H4]+;苯酞单体开环,脱去一分子H2O形成m/z173.095 9[M/2+H-H2O]+碎片离子,再脱去一分子CO产生碎片离子m/z145.101 4[M/2+H-H2O-CO]+(见图3),与文献[13]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物61为欧当归内酯A。

图3 欧当归内酯A可能的质谱裂解途径

2.2 有机酸类

2.2.1 氨基酸类

氨基酸类化合物因含有氨基和羧基而易丢失NH3、HCOOH、CO2、H2O等中性分子产生一系列特征碎片。本研究从茶芎中鉴定出11种氨基酸,包括6种人体必需氨基酸(化合物4、8、16、17、19、21)和5种人体非必需氨基酸(化合物1、2、6、9、19)。化合物21在正离子模式下准分子离子峰为m/z205.097 2[M+H]+,其裂解过程为丢失一分子NH3形成m/z188.070 9[M+H-NH3]+,再丢失一分子H2O形成m/z170.060 1[M+H-NH3-H2O]+;或者丢失两分子CO形成m/z132.080 6[M+H-NH3-2CO]+,再丢失一分子CH2形成m/z118.065 2[M+H-NH3-2CO-CH2]+;由[M+H]+丢失一分子HCOOH形成m/z159.091 6[M+H-HCOOH]+(见图4),与文献[21]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物21为色氨酸。

图4 色氨酸可能的质谱裂解途径

2.2.2 有机酚酸类

有机酚酸类成分是茶芎中活血化瘀的主要药效成分,该类成分多在负离子模式下响应较好,其裂解的方式主要有α裂解,以及中性CO2、CO、H2O分子的脱离。本研究从茶芎中鉴定出有机酚酸类化合物21个,包括13、15、18、20、22～29、34～36、41、43、49、70～72。化合物22在负离子模式下得到m/z353.088 0的分子离子峰,分析确定化合物分子式为C16H18O9,通过α裂解得到碎片离子m/z191.057 1[M-H-C9H6O3]-,继续脱去一分子H2O得到碎片m/z173.045 6[M-H-C9H6O3-H2O]-(见图5),与文献[23]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物22为绿原酸。

图5 绿原酸可能的质谱裂解途径

2.3 生物碱类

本研究共鉴定出生物碱类成分5个,包括化合物3、7、10～12,主要在正离子模式下以[M+H]+形式存在。化合物10在正离子模式下得到m/z245.077 0的分子离子峰,分析确定化合物分子式为C9H12N2O6,在高能量撞击下,失去一分子C5H8O4,产生了m/z113.034 9[M+H-C5H8O4]+的碎片离子峰,继续失去一分子OH,得到碎片离子m/z96.007 8[M+H-C5H8O4-OH]+,继而脱去一分子CN得到碎片离子m/z70.028 6[M+H-C5H8O4-OH-CN]+(见图6),与文献[24]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物10为尿苷。化合物12在正离子模式下得到m/z268.104 0的分子离子峰,分析确定化合物分子式为C10H13N5O4,在高能量撞击下,失去一分子C5H8O4,产生了m/z136.062 0[M+H-C5H8O4]+的碎片离子峰,继续失去一分子NH3,得到碎片离子m/z119.035 6[M+H-C5H8O4-NH3]+(见图7),与文献[14]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物12为腺苷。

图6 尿苷可能的质谱裂解途径

图7 腺苷可能的质谱裂解途径

2.4 其他类

本研究从茶芎中共鉴别出2个其他类成分,包括化合物5和化合物42。化合物5准分子离子峰为m/z341.109 9[M-H]-,在高能量撞击下,失去一分子C6H11O5,产生了m/z179.056 2的碎片离子峰,接着失去一分子H2O,形成m/z161.046 4[M-H-C6H11O5-H2O]-的碎片离子峰(见图8),与文献[25]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物5为蔗糖。化合物42正离子模式下形成质子化准分子离子m/z163.038 8[M+H]+,预测其分子式为C9H6O3,连续脱去两分子CO分别得到碎片离子m/z135.043 8[M+H-CO]+、m/z107.054 4[M+H-2CO]+(见图9),与文献[26,27]报道的裂解方式基本一致,故推测化合物42为伞形花内酯。

图8 蔗糖可能的质谱裂解途径

图9 伞形花内酯可能的质谱裂解途径

3 讨论与结论

本研究采用正离子和负离子两种离子化模式检测,通过保留时间、精确相对分子质量和二级质谱裂解碎片,对茶芎中的化合物进行了检测和鉴定,结果从茶芎中共鉴定出72个化合物,其中苯酞类化合物33个,有机酸类成分32个(包括11个氨基酸和21个有机酚酸类成分),生物碱类成分5个,其他类成分2个。对结果进行分析发现,茶芎中苯酞类和有机酸类成分种类最多,与现有文献[16]报道的结果基本一致。

苯酞类化合物是一类具有苯酞结构的有机化合物,是伞形科植物的特征性成分之一,在藁本属植物川芎和当归属植物当归中广泛存在[28],Han[15]总结现有研究成果发现,川芎药材中已分离鉴定出70余个苯酞类化合物;Zhang等[20]采用UPLC-Q-TOF/MS技术从当归中鉴定出55个苯酞类化合物。现代研究发现,苯酞类化合物具有防治心脑血管疾病、抗菌、抗肿瘤、抗炎、镇痛和杀虫等多种生物活性[28],例如,正丁基苯酞[29]、藁本内酯[30]和洋川芎内酯A[31]等成分可通过不同的机制保护大脑神经元免受脑缺血的损伤。

有机酸类成分是一类分子结构中含有羧基的化合物,在药用植物中广泛分布,主要富集于植物的根茎部位,如伞形科植物川芎和当归等,植物的叶和果实部位也有较高的含量。有机酸类成分可以调节体内的酸碱平衡、促进新陈代谢、增强免疫力、抗氧化、抗炎、抗菌等,其中氨基酸类成分是人体必需营养成分之一,能够促进机体新陈代谢,提高人体免疫力,如精氨酸有改善心脑血管疾病、增强机体免疫功能等作用[32];有机酚酸类成分具有抗氧化、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、调节免疫等作用[33],如阿魏酸能够延长小鼠凝血时间,减轻动静脉旁路模型大鼠血栓干、湿重,对血栓形成有明显抑制作用[34]。

因此本研究建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法可以快速准确且较全面地分析鉴定茶芎中的化学成分,为茶芎的质量控制和药效评价提供了科学依据,并为茶芎中其他未知组分的发现和鉴定奠定了基础。然而,本研究也存在一些局限性,例如化合物的结构推断不够准确,没有对特征性成分定量分析,没有考虑化合物之间的相互作用与协同效应等。基于此,未来的研究方向可从以下几方面展开:优化UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的分析条件和参数,提高茶芎中化合物的检测效率和准确度;利用其他的分析方法对茶芎中的化合物进行结构验证和补充,如核磁共振、红外光谱、紫外光谱等,提高茶芎中化合物的鉴定可靠性和完整性;对茶芎中的特征性成分进行定量分析,建立茶芎的质量标准和评价体系,反映茶芎中各种化合物的含量差异和相对贡献;结合药理学和生物学的方法,探究茶芎中化合物的作用机制和相互作用,阐明茶芎的药效物质基础和药效成分组合等。