云上杜鹃花化学成分及其抑制NO生成活性研究

段苑婷,程 琪,毕晓旭,王 莹,陈 冰,栾 杰,张高红,何江波*

1昆明学院医学院,昆明 650214;2云南省疾病预防与控制中心理化检测中心,昆明 650022

云上杜鹃(RhododendronpachypodumBalf.f.et W.W.Sm)为杜鹃花科杜鹃花属植物,又名波瓣杜鹃、白豆花,分布于滇东南、西南的大部分地区[1]。杜鹃花属植物具有清热解毒、活血止血等功效,民间将其根、叶用作草药进行内服和外用;该属植物化学成分种类多样、结构新颖,主要包括萜类、黄酮类、挥发油、香豆素、酚类等化学成分,其中以木藜芦烷型(grayannane)二萜为代表,具有显著的镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等生物活性[2,3]。目前的研究表明,杜鹃花属植物满山红、烈香杜鹃、羊踯躅、锦绣杜鹃等植物化学成分复杂,且具有良好的抗炎活性[4,5],而对于云南分布较为广泛的云上杜鹃还没有化学成分及生物活性研究。因此,为了探索云上杜鹃花的化学成分和生物活性,本实验通过系统分离方法从云上杜鹃花的乙酸乙酯萃取部位中分离得到26个化合物,并对全部化合物进行体外抗炎活性筛选。以期阐明云上杜鹃花的抗炎物质基础,为进一步开发云上杜鹃花的价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Avance 600 核磁共振仪(Bruker公司,TMS作为内标);质谱仪(安捷伦,6540 UHD Q-TOF/MS);Hanbon-NP7000C液相(汉邦仪器公司),半制备柱(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm);硅胶(200～300目)及薄层层析硅胶板(GF254,50 mm×100 mm)均为青岛海洋化工厂生产;Sephadex LH-20(25～100 μm,美国GE公司,批号:17009002);ODS-A(30～50 μm,日本YMC公司产品,批号:15340);色谱试剂:甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司)。显色剂为H2SO4(10%)乙醇溶液。RAW 264.7细胞(上海药物研究所);DMEM培养基(公司:Biological Industries,批号:06-1055-57-1ACS);胎牛血清(Bio-Channel公司,批号:BC-SE-FBS07);双抗(Biosharp公司,批号:BL505A);DMSO(索莱宝公司,批号:D8371)、LPS(Sigma公司,批号:L2880-25 mg);Griess试剂盒碧(云天公司,批号:S0023);MTT(碧云天公司,批号:ST1537-1 g);地塞米松(Sigma公司,批号:D4902-25 mg)。

云上杜鹃花于2020年5月采自云南省大理白族自治州石门关,经国家林业和草原局昆明勘察设计院王浩波研究员鉴定证实为杜鹃花科杜鹃花属云上杜鹃(RhododendronpachypodumBalf.f.et W.W.Sm)的花部位,样品凭证标本(标本编号2020-XB)现封存放于昆明学院医学楼药学实验室。

1.2 提取分离

云上杜鹃花部位38.0 kg,粉碎,采用工业甲醇加热回流提取,2 h/次,提取3次,提取液减压浓缩回收甲醇得到浸膏。浸膏采用热水溶解,然后依次采用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂各萃取3次;其中乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯后,得到1.1 kg浸膏,然后采用硅胶柱色谱进行分离,硅胶(200～300目,800 g)拌样,柱体积硅胶4.0 kg,硅胶柱(16 cm×120 cm)。依次用氯仿甲醇(100%→50%)梯度洗脱,每1 000 mL收集为1个流分。根据TLC检测,总共得到8个流分(XB-1～XB-8)。

其中组分XB-2(31 g)采用硅胶柱色谱(石油醚∶丙酮,20∶1)洗脱,得到组分XB-2 (1～2),其中XB-2-1利用正相硅胶柱色谱分离,再通过半制备液相(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm),90%乙腈洗脱得到化合物9(1.8 mg,tR=17.38 min);XB-3(40 g)组分经正相硅胶柱色谱(石油醚∶丙酮,20∶1→1∶1)梯度洗脱得到XB-3(1～2);XB-3-1用凝胶Sephadex LH-20柱分离,得到化合物21(6.7 mg)和22(3.1 mg);XB-3-2用凝胶Sephadex LH-20柱分离和ODS-A(甲醇∶水,10%→100%)梯度洗脱,得到XB-3-2(1～5),XB-3-2-1用正相硅胶柱色谱,采用石油醚∶乙酸乙酯,5∶1等度洗脱,获得化合物7(6.2 mg),XB-3-2-2经过凝胶Sephadex LH-20柱纯化得到化合物19(16.7 mg),XB-3-2-3经过反相半制备液相纯化(40%甲醇,3 mL/min)得到化合物23(22.7 mg,tR=13.62 min),XB-3-2-4采用反相半制备液相纯化(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm),50%甲醇洗脱得到化合物24(3.4 mg,tR=10.95 min),XB-3-2-5经过硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯,2∶1)等度洗脱获得化合物14(43.4 mg)和15(108 mg);组分XB-4(48 g)经过ODS-A(甲醇∶水,10%→100%)梯度洗脱和凝胶Sephadex LH-20柱分离,得到XB-4(1～6),XB-4-1采用正相硅胶柱色谱分离,以石油醚∶丙酮,6∶1等度洗脱,获得化合物10(10.7 mg)、17(3.5 mg),XB-4-2经过凝胶Sephadex LH-20柱纯化,得到化合物4(13.2 mg),XB-4-3经过硅胶柱色谱(石油醚∶丙酮,5∶1)等度洗脱得到化合物5(4.5 mg)、18(8.3 mg),XB-4-4经过凝胶Sephadex LH-20柱纯化,得到化合物20(5.8 mg),XB-4-5经过反相半制备液相(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm),80%甲醇洗脱得到化合物6(35 mg,tR=16.79 min),XB-4-6利用反相半制备液相(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm),60%甲醇洗脱得到化合物1(15.2 mg,tR=12.19 min)与3(6.8 mg,tR=13.56 min);组分XB-5(31 g)经过ODS-A(甲醇∶水,10%→100%)梯度洗脱和Sephadex LH-20(甲醇)柱色谱洗脱得到XB-5(1～6),其中XB-5-1采用正相硅胶柱,用石油醚∶乙酸乙酯,3∶1等度纯化得化合物2(9.1 mg)、16(22.6 mg),XB-5-2经过硅胶柱色谱(石油醚∶丙酮,10∶1)等度洗脱获得化合物25(14 mg),XB-5-3经过硅胶柱色谱(石油醚∶丙酮,8∶1)等度洗脱得到化合物26(3.2 g),XB-5-4经过半制备液相(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm),65%甲醇洗脱得到化合物11(9.6 mg,tR=12.68 min),XB-5-5经过半制备液相纯化(YMC-Triart C18,250 mm×10.0 mm,5 μm),50%甲醇洗脱得到化合物12(1.8 mg,tR=18.09 min)和13(2.3 mg,tR=21.52 min),XB-5-5采用凝胶Sephadex LH-20柱纯化,得到化合物8(26.5 mg)。

1.3 抑制NO生成活性研究

参考Lei等[6]的方法,采用MTT法检测各化合物对RAW 264.7细胞活力的影响。消化对数期生长的RAW 264.7细胞,计数,以1 × 105个细胞/孔铺96孔板,置于5% CO2、37°C培养箱培养过夜,次日加浓度为100 μmol/L的不同药物和地塞米松(DXM)预处理2 h,空白对照加DMSO处理,2 h之后再加LPS(1 μg/mL),继续培养24 h,紫色结晶充分溶解后,在490 nm测OD值计算抑制率。然后采用Griess法检测RAW 264.7细胞释放NO的含量。每孔里面换1 mL的无血清DMEM培养基,加入稀释好的化合物,浓度均为3.3、11、33、100 μmol/L,空白加等体积的DMSO,阳性对照加地塞米松(33 μmol/L)预处理2 h后,用无血清的DMEM培养基稀释标准品,其浓度分别是:0、1、2、5、10、20、40、60、和100 μmol/L。取待测样品和标准品各50 μL,加到新96孔板,每个样品设3个复孔,之后每孔加入50 μL Griess Reagent Ⅰ,接着再加入Griess Reagent Ⅱ,540 nm处测吸光值,然后计算化合物的IC50值。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1无色油状;ESI-MS:m/z435[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.46(1H,s,H-14),3.59(1H,dd,J=11.5,4.5 Hz,H-3),3.20(1H,overlap,H-1),2.62(1H,dd,J=11.9,4.5 Hz,H-2),2.10(3H,s,-COMe),1.36(3H,s,H-20),1.32(3H,s,H-19),1.17(3H,s,H-17),0.96(3H,s,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:51.6(C-1),35.7(C-2),83.2(C-3),52.4(C-4),84.9(C-5),74.3(C-6),43.8(C-7),51.3(C-8),56.8(C-9),79.2(C-10),22.8(C-11),27.8(C-12),55.5(C-13),83.8(C-14),60.8(C-15),79.9(C-16),24.1(C-18),19.4(C-19),27.9(C-20),21.6(C-21)172.7(C-22)。以上数据与文献[7]报道一致,故鉴定为梫木毒素I

化合物2无色油状;ESI-MS:m/z375[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.34(1H,s,H-14),5.11(1H,s,H-20β),4.99(1H,s,H-20α),4.05(1H,dd,J=9.2,2.6 Hz,H-6),3.65(1H,d,J=6.7 Hz,H-3),2.97(1H,m,H-1),2.67(1H,t,J=7.4 Hz,H-9),2.03(1H,d,J=14.9 Hz,H-15α),1.97(1H,d,J=14.9 Hz,H-15β),1.90(1H,m,H-12α),1.74(1H,m,H-12β),1.69(2H,m,H-11),1.42(3H,s,H-17),1.23(3H,s,H-19),1.02(3H,s,H-18);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:44.4(C-1),38.9(C-2),82.4(C-3),49.3(C-4),82.9(C-5),70.1(C-6),40.5(C-7),50.7(C-8),51.1(C-9),151.5(C-10),24.1(C-11),25.6(C-12),53.0(C-13),80.3(C-14),60.5(C-15),81.8(C-16),24.0(C-17),23.6(C-18),18.5(C-19),113.9(C-20)。以上数据与文献[8]报道一致,故鉴定为梫木毒素 II。

化合物3无色油状;ESI-MS:m/z375[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.07(1H,s,H-20α),5.00(1H,s,H-20β),3.78(1H,dd,J=9.6,1.8 Hz,H-6),3.60(1H,dd,J=6.6,2.4 Hz,H-3),2.97(1H,t,J=9.0 Hz,H-1),2.49(1H,t-like,H-9),2.39(1H,m,H-2α),1.19(3H,s,H-19),1.12(3H,s,H-17),0.97(3H,s,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:45.2(C-1),38.8(C-2),82.4(C-3),51.3(C-4),84.0(C-5),71.7(C-6),47.0(C-7),40.9(C-8),49.0(C-9),153.1(C-10),28.2(C-11),32.4(C-12),81.0(C-13),60.3(C-15),78.8(C-16),21.4(C-17),24.4(C-18),19.0(C-19),119.7(C-20)。以上数据与文献[9]报道一致,故鉴定为pieristoxin S。

化合物4无色油状;ESI-MS:m/z245[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.83(1H,d,J=15.7 Hz,H-7),6.47(1H,d,J=15.7 Hz,H-8),5.96(1H,t-like,H-4),2.31(3H,s,H-10),1.11(3H,s,H-11),1.02(3H,s,H-12);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:41.6(C-1),49.8(C-2),197.6(C-3),128.1(C-4),160.4(C-5),79.5(C-6),145.1(C-7),130.6(C-8),197.1(C-9),28.6(C-10),24.5(C-11),23.1(C-12),18.9(C-13)。以上数据与文献[10]报道一致,故鉴定为去氢催吐萝芙木醇。

化合物5无色油状;ESI-MS:m/z213[M+H]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:3.94(1H,m,H-3),3.80(1H,m,H-9),2.24(1H,dd,J=16.2,5.3 Hz,H-4α),2.18(2H,m,H-7),1.71(1H,m,H-4β),1.67(1H,m,H-2α),1.62(3H,s,H-13),1.51(2H,m,H-8),1.42(1H,m,H-2β),1.21(3H,d,J=6.2 Hz,H-10),1.03(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:37.9(C-1),48.5(C-2),65.3(C-3),42.3(C-4),124.1(C-5),136.8(C-6),24.4(C-7),39.7(C-8),68.8(C-9),23.4(C-10),28.5(C-11),29.7(C-12),19.7(C-13)。以上数据[11]与文献报道一致,故鉴定该化合物为megastigm-5-en-3,9-diol。

化合物6白色粉末;ESI-MS:m/z247[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.91(1H,s,H-4),5.86(1H,m,H-8),5.79(1H,d,J=15.8 Hz,H-7),4.41(1H,m,H-9),2.45(1H,dd,J=17.0,4.7 Hz,H-2α),2.25(1H,d,J=17.0 Hz,H-2β)1.91(3H,s,H-13),1.30(3H,d,J=6.7 Hz,H-10),1.08(3H,s,H-11),1.01(3H,s,H-12);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:41.4(C-1),49.9(C-2),198.3(C-3),127.1(C-4),163.1(C-5),79.3(C-6),129.1(C-7),135.9(C-8),68.2(C-9),24.3(C-10),23.1(C-11),24.0(C-12),19.1(C-13)。以上数据与文献[12]报道一致,故鉴定为吐叶醇。

化合物7无色油状;ESI-MS:m/z247[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.03(1H,d,J=15.4 Hz,H-7),6.29(1H,d,J=15.4 Hz,H-8),2.28(3H,s,H-10),1.58(3H,s,H-13)1.19(3H,s,H-11),0.98(3H,s,H-12);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:35.1(C-1),40.6(C-2),64.0(C-3),47.0(C-4),67.3(C-5),69.5(C-6),142.4(C-7),132.6(C-8),197.4(C-9),28.3(C-10),29.4(C-11),25.0(C-12),19.9(C-13)。以上数据与文献[13]报道一致,故鉴定为5,6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物8无色油状;ESI-MS:m/z223[M-H]-;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.90(1H,s,H-4),5.80～5.83(2H,m,H-7/8),4.34(1H,m,H-9),2.52(1H,dd,J=16.9,3.5 Hz,H-2α),2.19(1H,d,J=16.3 Hz,H-2β),1.94(3H,dd,J=5.3,1.1 Hz,H-13);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:42.5(C-1),50.8(C-2),201.3(C-3),127.1(C-4),167.5(C-5),80.0(C-6),137.0(C-7),130.0(C-8),68.8(C-9),24.5(C-10),23.9(C-11),23.5(C-12),19.6(C-13)。以上数据与文献[14]报道一致,故鉴定为hydroxy-3-oxo-a-ionol。

化合物9无色油状;ESI-MS:m/z291[M+H]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.94(1H,dd,J=17.3,10.7 Hz,H-2),5.24(1H,d,J=17.3 Hz,H-1β),5.16(1H,t,J=7.2 Hz,H-6),5.13(2H,m,H-10,14),5.09(1H,d,J=10.7 Hz,H-1α),2.04(10H,m,H-5,H-8,H-9,H-12,H-13),1.70(3H,s,H-16),1.63(6H,s,H-18,19),1.62(3H,s,H-20),1.58(2H,m,H-4);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:111.9(C-1),145.3(C-2),73.7(C-3),42.3(C-4),22.9(C-5),124.6(C-6),135.9(C-7),39.9(C-8),27.0(C-9),124.4(C-10),135.3(C-11),39.9(C-12),26.8(C-13),124.3(C-14),131.5(C-15),25.9(C-16),28.1(C-17),16.3(C-18),16.2(C-19),17.9(C-20)。以上数据与文献[15]报道一致,故鉴定为香叶芳樟醇。

化合物10无色油状;ESI-MS:m/z293[M+K]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.92(1H,dd,J=17.4,10.7 Hz,H-2),5.60(1H,m,H-5),5.60(1H,m,H-6),5.20(1H,d,J=17.3 Hz,H-1α),5.06(1H,d,J=10.7 Hz,H-1β),1.81(2H,q,J=7.2 Hz,H-9),1.31(3H,s,H-14),1.26(3H,s,H-12),1.21(3H,s,H-15),1.12(3H,s,H-13);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:112.2(C-1),145.0(C-2),72.8(C-3),45.4(C-4),122.3(C-5),140.5(C-6),82.9(C-7),38.1(C-8),26.6(C-9),85.7(C-10),71.4(C-11),27.4(C-12),24.3(C-13),27.4(C-14),27.6(C-15)。以上数据与文献[16]报道一致,故鉴定为negunfurol。

化合物11无色油状;ESI-MS:m/z279[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.91(1H,dd,J=17.3,11.0 Hz,H-11),5.22(1H,d,J=17.4 Hz,H-12α),5.21(1H,m,H-7),5.07(1H,dd,J=10.7,1.4 Hz,H-12β),3.35(1H,dd,J=10.7,2.0 Hz,H-3),2.23(1H,m,H-5α),2.05(3H,m,H-5β,8),1.62(3H,s,H-14);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:26.4(C-1),73.0(C-2),78.2(C-3),29.6(C-4),36.8(C-5),135.1(C-6),125.0(C-7),22.7(C-8),41.9(C-9),73.5(C-10),145.0(C-11),111.8(C-12),23.2(C-13),15.9(C-14),28.0(C-15)。以上数据与文献[17]报道一致,故鉴定为2,6,10-trimethyldodeca-6,11-diene-2,3,10-triol。

化合物12无色油状;ESI-MS:m/z251[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.15(1H,dt,J=7.1,1.5 Hz,H-5),3.33(1H,d,J=10.6 Hz,H-9),2.48(2H,t,J=7.3 Hz,H-3),2.28(2H,m,H-4),2.14(3H,s,H-1),1.98～2.10(2H,m,H-7),1.64(3H,s,H-11),1.37～1.43(2H,m,H-8),1.20(3H,H-12),1.16(3H,H-13);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:30.0(C-1),208.9(C-2),43.6(C-3),22.4(C-4),123.3(C-5),136.2(C-6),36.8(C-7),29.6(C-8),78.2(C-9),73.0(C-10),15.9(C-11),26.4(C-12),23.3(C-13)。以上数据与文献[18]报道一致,故鉴定为9,10-dihydroxy-6,10-dimethylundec-5-en-2-one

化合物13无色油状;ESI-MS:m/z171[M+H]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.90(1H,dd,J=17.3,10.7 Hz,H-7),5.31(1H,t,J=7.5 Hz,H-3),5.22(1H,dd,J=17.4,0.9 Hz,H-8α),5.07(1H,dd,J=10.7,1.0 Hz,H-8β),4.12(2H,dd,J=11.9,5.1 Hz,H-1),2.12(2H,m,H-4),1.79(3H,d,J=1.6 Hz,H-9),1.41(2H,m,H-5),1.29(3H,s,H-10);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:61.6(C-1),134.6(C-2),128.5(C-3),22.4(C-4),42.0(C-5),73.5(C-6),144.9(C-7),111.9(C-8),21.5(C-9),28.2(C-10)。以上数据与文献[19]报道一致,故鉴定为(2Z)-2,6-dimethyl-2,7-octadiene-1,6-diol。

化合物14黄色粉末;ESI-MS:m/z411[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,C5D5N)δ:11.12(1H,s,4′-OH),10.84(1H,s,4-OH),7.30(1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),7.28(1H,s,H-2′),7.12(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),7.02(2H,s,H-2,6),4.40(2H,s,H-7,7′),4.08(2H,m,H-9,9′),3.86(6H,s,3,5-OMe),3.80(3H,s,3′-OMe),3.31(2H,m,H-8,8′);13C NMR(150 MHz,C5D5N)δ:132.9(C-1),105.4(C-2,6),57.1(3,5-OMe),149.9(C-3,5),56.6(3′-OMe),137.9(C-4),87.3(C-7),55.7(C-8),72.8(C-9),133.8(C-1′),111.6(C-2′),149.5(C-3′),148.5(C-4′),117.1(C-5′),120.4(C-6′),87.1(C-7′),55.4(C-8′),72.5(C-9′)。以上数据与文献[20]报道一致,故鉴定为medioresinol。

化合物15无色油状;ESI-MS:m/z381[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.91(2H,d,J=2.0 Hz,H-2/2′),6.89(2H,d,J=8.3 Hz,H-5/5′),6.82(2H,dd,J=8.3,2.0,H-6/6′),4.74(2H,d,J=4.3 Hz,H-7/7′),4.25(2H,m,H-9β/9′β),3.90(6H,s,2×-OMe),3.88(2H,dd,J=9.2,3.6 Hz,H-9α/9′α),3.11(2H,m,H-8/8′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.1(C-1/1′),108.8(C-2/2′),146.9(C-3/3′),145.4(C-4/4′),114.5(C-5/5′),119.2(C-6/6′),86.1(C-7/7′),54.4(C-8/8′),71.9(C-9/9′),56.2(2×-OMe)。以上数据与文献[21]报道一致,故鉴定为松脂素。

化合物16无色油状;ESI-MS:m/z383[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.95(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),6.82(1H,dd,J=8.1,1.9 Hz,H-5),6.76(1H,d,J=8.1 Hz,H-6),6.72(2H,s,H-2′/6′),5.49(1H,d,J=6.2 Hz,H-7),3.84(3H,s,4-OMe),3.82(1H,overlap,H-9β),3.81(3H,s,3-OMe),3.75(1H,m,H-8),3.57(2H,t,J=6.5 Hz,H-9′),3.47(1H,dd,J=6.3,6.1 Hz,H-9α),2.62(2H,t,J=8.0 Hz,H-7′),1.82(2H,m,H-8′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:137.1(C-1/1′),110.7(C-2),149.2(C-3),147.6(C-4),114.2(C-5),119.9(C-6),89.1(C-7),55.6(C-8),65.1(C-9),116.3(C-2′),134.9(C-3′),145.4(C-4′),130.0(C-5′),118.1(C-6′),33.1(C-7′),36.0(C-8′),62.9(C-9′),56.9(3-OMe),56.5(4-OMe)。以上数据与文献[22]报道一致,故鉴定4-O-甲基雪松素。

化合物17黄色粉末;ESI-MS:m/z273[M+H]+;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.31(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′/6′),6.82(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′/5′),5.89(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),5.88(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),2.68(1H,dd,J=17.2,3.0 Hz,H-3α);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:80.6(C-2),44.2(C-3),198.0(C-4),165.6(C-5),97.2(C-6),168.5(C-7),96.3(C-8),165.0(C-9),103.5(C-10),131.2(C-1′),129.2(C-2′/6′),116.5(C-3′/5′),159.2(C-4′)。以上数据与文献[23]报道一致,故鉴定该柚皮素。

化合物18黄色粉末;ESI-MS:m/z339[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.36(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′/6′),6.84(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′/5′),4.91(1H,d,J=11.5 Hz,H-3),4.51(1H,d,J=11.5 Hz,H-2),2.00(3H,s,H-11),1.94(3H,s,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:72.6(C-2),83.5(C-3),197.3(C-4),158.9(C-5),104.1(C-6),162.7(C-7),103.3(C-8),157.9(C-9),100.1(C-10),128.6(C-1′),129.0(C-2′/6′),114.9(C-3′/5′),157.8(C-4′),6.3(C-11),6.8(C-12)。以上数据与文献[24]报道一致,故鉴定为6,8-di-C-methyldihydrokaempferol。

化合物19黄色粉末;ESI-MS:m/z191[M-H]-;1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.81(1H,s,5-OH),6.31(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.16(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.15(1H,s,H-3),2.33(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:167.7(C-2),107.9(C-3),181.8(C-4),161.5(C-5),98.7(C-6),164.1(C-7),93.7(C-8),157.8(C-9),103.4(C-10),19.9(C-11)。以上数据与文献[25]报道一致,故鉴定为去甲基丁香色原酮。

化合物20黄色油状;ESI-MS:m/z181[M-H]-;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.84(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.70(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.69(1H,dd,J=8.1,2.0 Hz,H-6),5.48(1H,s,4-OH),3.88(3H,s,3-OMe),3.68(2H,m,H-3′),2.65(2H,t,J=7.7 Hz,H-1′),1.87(2H,m,H-2′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.7(C-1),110.9(C-2),146.4(C-3),143.7(C-4),114.2(C-5),120.9(C-6),34.5(C-1′),31.8(C-2′),62.3(C-3′),55.9(3-OMe)。以上数据与文献[26]报道一致,故鉴定为二氢松柏醇。

化合物21黄色粉末;ESI-MS:m/z357[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.23(1H,td,J=7.2,1.2 Hz,H-5),5.20(2H,s,H-13),3.76(3H,s,H-17),3.62(3H,s,H-18),3.38(2H,d,J=6.6 Hz,H-6),2.40(2H,dd,J=9.0,6.6 Hz,H-2),2.30(2H,dd,J=8.6,7.2 Hz,H-3),2.15(3H,s,H-16),1.80(3H,s,H-15);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:174.1(C-1),33.1(C-2),34.8(C-3),134.4(C-4),122.9(C-5),22.8(C-6),122.4(C-7),153.9(C-8),106.6(C-9),116.9(C-10),144.2(C-11),163.9(C-12),70.3(C-13),173.2(C-14),16.3(C-15),11.2(C-16),61.2(C-17),51.7(C-18)。以上数据与文献[27]报道一致,故鉴定为mycophenolic methyl ester。

化合物22无色晶状;ESI-MS:m/z183[M+H]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:11.74(1H,s,2-OH),6.28(1H,d,J=2.1 Hz,H-5),6.23(1H,J=2.1 Hz,H-3),5.23(1H,s,4-OH),3.92(3H,s,COOMe),2.49(3H,s,Me-8);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:105.9(C-1),160.4(C-2),101.5(C-3),165.6(C-4),111.5(C-5),144.2(C-6),172.3(C-7),24.5(C-8),52.1(COOMe)。以上数据与文献[28]报道一致,故鉴定为苔色酸甲酯。

化合物23无色油状;ESI-MS:m/z191[M-H]-;1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.89(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),6.76(1H,s,H-8),6.19(1H,d,J=9.3 Hz,H-3),3.50(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:160.7(C-2),111.4(C-3),144.5(C-4),109.5(C-5),145.4(C-6),149.6(C-7),102.8(C-8),151.5(C-9),110.3(C-10),56.0(C-11)。以上数据与文献[29]报道一致,故鉴定为东莨菪亭。

化合物24无色油状;ESI-MS:m/z123[M-H]-;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.22(1H,t,J=7.8 Hz,H-4),7.05(1H,d,J=7.5 Hz,H-6),6.90(1H,d,J=8.1 Hz,H-3);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:124.7(C-1),156.4(C-2),116.8(C-3),128.0(C-4),120.3(C-5),129.8(C-6),65.0(C-7)。以上数据与文献[30]报道一致,故鉴定为水杨醇。

化合物25无色油状;ESI-MS:m/z189[M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.11(2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.75(2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5),3.70(3H,s,4-OMe),3.56(2H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:130.7(C-1),126.0(C-2,6),115.8(C-3,5),155.2(C-4),40.5(C-7),173.3(C-8),52.4(4-OMe)。以上数据与文献[31]报道一致,故鉴定为甲氧基苯乙酸。

化合物26无色油状;ESI-MS:m/z125[M+H]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.24(2H,d,J=2.3 Hz,H-4/6),6.17(1H,t,J=2.3 Hz,H-2),2.24(3H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:156.8(C-1/3),100.1(C-2),108.9(C-4,6),141.2(C-5),21.6(C-7)。以上数据与文献[32]报道一致,故鉴定为苔黑酚。

化合物1～26结构式见图1。

图1 云上杜鹃花的化学结构

2.2 抑制NO生成活性研究结果

根据MTT法检测各化合物对RAW 264.7细胞活性影响,在490 nm测OD值计算抑制率,结果显示浓度为100 μmol/L时化合物4、16、17、18、23对细胞活力均无显著影响;Griess法检测RAW 264.7细胞释放NO的含量,阳性药物选用地塞米松,加入稀释好的化合物4、13、14、16、18、23浓度均为3.3、11、33、100 μmol/L,空白加等体积的DMSO,阳性对照加地塞米松(33 μmol/L);抗炎活性实验结果显示化合物13、16和18均能抑制LPS诱导的RAW 264.7释放NO而表现出较好的抗炎活性,其IC50分别是:75.4±2.7、33.5±1.5和85.4±4.3 μmol/L,阳性药物地塞米松在33.0 μmol/L下显著抑制LPS激活的RAW 264.7细胞释放NO。

3 结论

杜鹃花在云南分布广泛,资源丰富,云南拥有包含亚种和变种在内的杜鹃花320种,占全中国的56%,世界的31%[33]。云南民族地区食花习俗由来已久,长期野外实践表明杜鹃花颜色越深毒性越大,人们通常只食用少数白色和浅色的杜鹃花,故白色的云上杜鹃花也存在于云南人的食谱当中[34]。云上杜鹃因其仅在云南部分地区分布,尚无成分与活性的研究报道。为研究云上杜鹃花作为菜食花的安全性以及探索其中的抗炎成分,本课题组对云上杜鹃花化学成分进行研究,结果分离得到26个化合物。查阅相关文献发现,我们报道的化合物均没有相关抗炎活性报道。因此,对部分单体化合物进行NO释放抑制活性筛选,发现化合物(2Z)-2,6-dimethyl-2,7-octadiene-1,6-diol(13)、4-O-甲基雪松素(16)、6,8-di-C-methyldihydrokaempferol(18)能对LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞中NO的释放有抑制作用,其中化合物4-O-甲基雪松素表现出明显的抗炎活性,IC50值达到33.5±1.5 μmol/L。此外,本次研究从云上杜鹃花中分离得到3个木藜芦烷型毒素(化合物1～3),文献[35]报道这3个化合物具有显著的镇痛活性,但是这类化合物属于神经心脏系统毒素,能够增强心肌收缩力,也能引发心脏快速心律失常以致抑制心脏跳动而致死[3]。关于木藜芦毒素的研究,国外研究者报道较多,特别是在一些蜂蜜中会检测到该类毒素的存在。因此云上杜鹃花的食用安全性还有待进一步的研究。