黄姜花花的化学成分、抗氧化、酶抑制活性及抗炎作用研究

丁芙蓉,贾小演,吴相欢,吴 霞,杨 念,刘雄利,田民义*

1贵州大学酿酒与食品工程学院;2贵州大学生命科学学院;3西南药食两用资源开发利用技术国家地方联合工程研究中心,贵阳 550025

黄姜花(HedychiumflavumRoxb.)为姜科姜花属植物,具有食用、药用和观赏价值,主要分布于我国贵州、四川、西藏、云南、广西等地,也在缅甸、泰国和印度被广泛种植[1,2]。贵州毕节地区称黄姜花为草果,是一种当地特色食品。现有研究表明,黄姜花根状茎具有多种药理作用,如抗炎、抗菌、抗真菌、抗癌、杀虫和酶抑制活性等[2-4],被用作食物调味料和中药[5-6],它的嫩芽被用作调味品和蔬菜。黄姜花的花可作为食品调味料,其香气浓郁且易挥发,人们为了使腌制品中增添浓郁的清香味,常将其添加到剁椒和辣椒酱中,同时新鲜的花瓣可作为炒菜的佐料。黄姜花的花浸膏用于调合香精[7]。此外,黄姜花的花有健胃止痛,温中散寒的作用,常用于治疗消化不良、腹泻、胃寒腹痛、食积停滞等相关疾病[6,8]。黄姜花的花挥发油可在化妆品中使用,有芳香健胃的作用[6]。课题组前期的研究表明黄姜花的花挥发油具有显著的体内外抗炎作用[9]。目前国内对黄姜花花的研究较少,其花非挥发性物质的化学成分和药理活性尚未有报道。所以本实验主要研究黄姜花花提取物的化学成分、抗氧化活性、酶抑制活性和抗炎活性。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采购于2019年4月,产自广西贵港,由贵州大学植物学专家胡国雄教授鉴定为姜科姜花属黄姜花(HedychiumflavumRoxb.)的花,标本(编号:HF-20190421)保存于贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心。RAW 264.7细胞(中国科学院昆明细胞库)。无水硫酸钠和无水乙醇(色谱纯,山东维进化工公司);MTT(98%,批号:530R0511)、二丁基羟基甲苯(BHT)(纯度98%,批号:BCBV3237)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)(纯度98%,批号:SLCH3887)、酪氨酸酶(批号:SLCG8506)、L-酪氨酸(98%,批号:VD223127)、熊果苷(纯度98%,批号:A1026A025)、α-葡萄糖苷酶(批号:G7352E90B)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(纯度99%,批号:H1909087)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,纯度98%,批号:STBH7297)、阿卡波糖(纯度98%,批号:J1824027)、乙酰胆碱酯酶(批号:SLCJ4242)(德国Sigma公司);胎牛血清(批号:22110705,杭州四季青生物公司);丁酰胆碱酯酶(批号:SLCF8252,上海星科生物公司);PGE2ELISA试剂盒(批号:PEQBP5RT2B,中国台湾Abnova公司);TNF-αELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒(批号:A28221056、A20611035,杭州联科公司);IL-1βELISA试剂盒(批号:20221206,泉州睿信生物公司);二甲基亚砜(DMSO)(分析纯,批号:20220920)、地塞米松(纯度98%,批号:104J054)、脂多糖(LPS)(纯度99%,批号:622P022)(北京索莱宝公司);高糖DMEM和双抗(批号:8122757、192814,北京鼎国昌盛生物公司);碘代乙酰胆碱(批号:C10120826,上海晶抗生物公司);加兰他敏(纯度98%,批号:324E021,上海源叶生物科技有限公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备

将新鲜黄姜花的花洗净后粉碎,置于圆底烧瓶(2 L)中,加入蒸馏水(或70%乙醇)采用回流提取法进行提取(2 h)后抽滤,重复操作2次。将两次收集的滤液混合后浓缩,浓缩液冷冻干燥得水提物和醇提物。

1.2.2 总酚酸总黄酮含量测定

1.2.2.1 总酚酸含量测定

总酚酸含量采用福林酚法(Folin-Ciocalteu)[10]测定。样品溶液(0.5 mL)中加入福林酚试剂(2.5 mL)孵育4 min,然后加入碳酸钠溶液(2 mL,7.5%),孵育60 min后测定其吸光值,测定波长为760 nm。以试剂为空白参比,没食子酸为对照品建立坐标轴,绘制标准曲线。以每克样品相当于多少毫克的没食子酸表示总酚含量(mg GAEs/g sample)。

1.2.2.2 总黄酮含量测定

总黄酮含量采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)[11]测定。样品溶液(5 mL)中加入亚硝酸钠溶液(0.4 mL,5%),孵育6 min,加入硝酸铝溶液(0.4 mL,10%)孵育6 min,加入氢氧化钠溶液(4 mL,4%)后再加入蒸馏水使总体积为10 mL,孵育15 min后测定其吸光值,测定波长为510 nm。以试剂为空白参比,芦丁为对照品建立坐标轴,绘制标准曲线。以每克样品相当于多少毫克的芦丁表示总黄酮含量(mg REs/g sample)。

1.2.3 化学成分分析

采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱串联质谱(UHPLC-Q-Orbitrap MS)分析提取物化学成分。液相系统:Dionex Ultimate 3000 RSLC(HPG)。流动相:乙腈(含0.1%甲酸)和0.1%甲酸水;进样体积5 μL;流速0.3 mL/min;柱温:40 ℃;色谱柱:ACE Ultracore 2.5 Super C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)。梯度洗脱程序:0～2 min,5%A;2～42 min,5%→95%A;42～47 min,95%A;47～47.1 min,95%→5%A;47.1～50 min,5%A。质谱系统:Thermo Scientific Q Exactive Focus,热喷雾离子源HESI-II。离子源参数:喷雾电压3.0 kV(+)/2.5 kV(-);鞘气35 arb;毛细管温度320 ℃;辅助气10 arb;挡锥气0 arb;探头加热器温度 350 ℃。质谱扫描参数:扫描方式为Full MS-ddMS2;分辨率为70000(Full MS)和17500(MS/MS);扫描范围为100～1500m/z;最大驻存时间为100 ms(Full MS)和50 ms(MS/MS);AGC目标为1e6(Full MS)和2e5(MS/MS);最小AGC目标为8e3。质谱数据使用Xcalibur 4.1(美国赛默飞世尔科技公司)处理,并通过mzVault和mzCloud数据库进行比较鉴定,允许相对质量偏差设置为10×10-6。

1.2.4 抗氧化活性测定

1.2.4.1 清除DPPH自由基能力测定

参照Zhai等[12]的方法进行本实验,实验组(As):2 mL样品溶液与2 mL DPPH溶液;样品空白组(Ar):2 mL样品溶液与2 mL溶剂;溶剂空白组(A0):2 mL溶剂与2 mL DPPH溶液;以上三组于避光室温下孵育30 min后测量吸光值(波长517 nm)。BHT为阳性对照,结果以每克样品相当于多少毫克的BHT(mg BEs/g sample)表示。按公式(1)计算DPPH自由基清除率(RC)。

Rc=(1-(As-Ar)/A0)×100%

(1)

1.2.4.2 清除ABTS自由基能力测定

本实验参照Zhai等[12]的方法进行,实验组(As):0.4 mL样品溶液与4 mL ABTS工作液;样品空白组(Ar):0.4 mL样品溶液与4 mL溶剂;溶剂空白组(A0):0.4 mL溶剂与4 mL ABTS工作液;以上三组避光反应10 min后测量吸光值(波长734 nm)。BHT为阳性对照。结果以每克样品相当于多少毫克的BHT(mg BEs/g sample)表示。ABTS自由基清除率按公式(1)计算。

1.2.5 酶抑制活性测定

1.2.5.1 胆碱酯酶抑制活性测定

参考Lu等[13]的方法,底物选择碘代乙酰胆碱和硫代丁酰胆碱,阳性对照选择加兰他敏。样品组(A1):样品溶液(50 μL)中加入乙(丁)酰胆碱酯酶(10 μL,pH 8,0.5 U/mL),在4 ℃反应15 min。加入二硫代双硝基苯甲酸(20 μL,2 mmol/L)和底物(20 μL,2 mmol/L),在37 ℃反应30 min。最后测量吸光值(波长405 nm)。样品空白组(A2):按以上步骤将乙(丁)酰胆碱酯酶换成缓冲液(pH 8);阴性组(A3):按以上步骤将样品溶液换成缓冲液(pH 8);空白组(A4):按以上步骤将乙(丁)酰胆碱酯酶和样品溶液都换成缓冲液(pH 8)。结果以IC50值和每克样品相当于多少毫克的加兰他敏(mg GALAEs/g sample)表示。乙(丁)酰胆碱酯酶抑制率(RI)计算如公式(2)所示:

RI=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%

(2)

1.2.5.2 酪氨酸酶抑制活性测定

参考Lu等[13]的方法,底物选择L-酪氨酸,阳性对照为熊果苷。样品组(A1):样品溶液(70 μL)中加入酪氨酸酶(100 μL,100 U/mL)并在37 ℃反应5 min。加入底物(80 μL,5.5 mmol/L)后在37 ℃孵育30 min。最后测定吸光值(波长492 nm)。样品空白组(A2):按以上步骤将酪氨酸酶换成缓冲液(pH 6.8);阴性组(A3):按以上步骤将样品溶液换成缓冲液(pH 6.8);空白组(A4):按以上步骤将酪氨酸酶和样品溶液都换成缓冲液(pH 6.8)。结果以IC50值和每克样品相当于多少毫克的熊果苷(mg AREs/g sample)表示。酪氨酸酶抑制率按公式(2)计算。

1.2.5.3α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

参考Lu等[13]的方法,底物选择硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(p-NPG),阳性对照选择阿卡波糖。样品组(A1):将样品溶液(30 μL)与α-葡萄糖苷酶(10 μL,0.8 U/mL)加入缓冲液(60 μL,pH 6.8)中,在37 ℃反应15 min。然后加入底物(10 μL,1 mol/L),在37 ℃反应15 min。最后加入碳酸钠溶液(80 μL,0.2 moL/L)停止反应,测定吸光值(波长405 nm)。样品空白组(A2):按以上步骤将α-葡萄糖苷酶换成缓冲液(pH 6.8);阴性组(A3):按以上步骤将样品溶液换成缓冲液(pH 6.8);空白组(A4):按以上步骤将α-葡萄糖苷和样品溶液都换成缓冲液(pH 6.8)。结果以IC50值和每克样品相当于多少毫摩尔的阿卡波糖(mmol ACEs/g sample)表示。α-葡萄糖苷酶抑制率按公式(2)计算。

1.2.6 抗炎活性测定

1.2.6.1 细胞毒性测定

样品溶液对RAW 264.7细胞系的细胞毒性作用通过MTT法进行评估[14]。在96孔板中加入100 μL RAW 264.7细胞(2×104个细胞/孔)培养24 h后,将溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的样品用DMEM培养基从500 μg/mL连续半倍稀释至31.25 μg/mL,吸出旧培养基并加入100 μL样品溶液培养24 h。加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)后培养4 h,去除上清液,加入150 μL二甲基亚砜后震荡10 min,测量吸光值(波长490 nm)。

1.2.6.2 促炎症介质和细胞因子释放量测定

将RAW 264.7细胞用LPS诱导后取上清液,采用Griess法和ELISA试剂盒检测样品对上清液中NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影响。在96孔板中加入100 μL RAW 264.7细胞(2×104个细胞/孔)培养24 h后,吸出旧培养基加入100 μL样品溶液培养2 h,然后加入100 μL LPS(1 μg/mL)培养24 h,收集上清液。设定空白组(control,CON)、模型组(LPS)、阳性对照(地塞米松,DXM)和样品组。根据NO试剂盒和ELISA试剂盒说明书检测评估NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.2.7 统计分析

2 结果

2.1 黄姜花花提取物总酚酸总黄酮含量测定

黄姜花花水提物和醇提物的产率分别为(0.93±0.04)%和(0.59±0.03)%,其总酚酸及总黄酮含量如图1所示。水提物和醇提物的没食子酸当量值分别为25.78±0.09 mg GAEs/g sample和34.04±0.83 mg GAEs/g sample;芦丁当量分别为73.21±0.58 mg REs/g sample和41.51±0.72 mg REs/g sample。分析结果表明,醇提物总酚酸含量显著高于水提物(P<0.01),水提物总黄酮含量显著高于醇提物(P< 0.01)。

图1 黄姜花花提取物的产率和总酚酸、总黄酮含量

2.2 黄姜花花提取物化学成分分析

从黄姜花花水提物中鉴定出42种化合物,含有7种酚类化合物和11种黄酮类化合物;从黄姜花花醇提物鉴定出50种化合物,包括9种酚类化合物和17种黄酮类化合物。两种提取物一共分析鉴定出58种化合物(图2、表1),其中,酚类化合物共有11种:丁香醛、大麦芽碱、香草酸、七叶亭、对羟基肉桂酸、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、松柏醛、咖啡酸乙酯、阿魏酸乙酯、6-姜酚、去氢二异丁香酚,结构式见图3A。黄酮类化合物共有18种:二氢田基黄苷、维采宁II、罗汉果黄素、杨梅苷、异槲皮苷、野黄芩苷、槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素、槲皮甙、桑黄素、苏木素、山柰酚、异鼠李素、异黄腐醇、香叶木素,其结构式见图3B。酚类化合物代表(香草酸,6-姜酚)和黄酮类化合物代表(罗汉果黄素,槲皮素)的质谱裂解途径如图4～7所示。

表1 黄姜花花提取物的植物化学成分

图2 黄姜花的花醇提物和水提物的UHPLC-Q-Orbitrap-MS色谱图

图3 黄姜花花提取物酚类和黄酮类化合物结构

图4 香草酸的裂解途径

图5 6-姜酚的裂解途径

图6 罗汉果黄素的裂解途径

图7 槲皮素的裂解途径

2.3 黄姜花花提取物的抗氧化活性

由表2可知,黄姜花花水提物和醇提物对DPPH和ABTS自由基都有较好的抗氧化活性。二者对DPPH自由基的IC50值分别为165.78±2.45 μg/mL和163.70±2.84 μg/mL,BHT当量分别为667.14±9.95 mg BEs/g sample和679.32±12.00 mg BEs/g sample;对ABTS自由基的IC50值分别为104.97±8.27 μg/mL和99.69±2.97 μg/mL,BHT当量为129.53±10.24 mg BEs/g sample和135.91±4.05 mg BEs/g sample。

表2 黄姜花花提取物的抗氧化活性

2.4 黄姜花花提取物的酶抑制活性

由表3可知,黄姜花花提取物对α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、乙(丁)酰胆碱酯酶有一定的抑制作用,水提物的阳性当量值分别为0.09±0.01 mmol ACEs/g sample、2.62±0.16 mg AREs/g sample、0.05±0.006 mg GALAEs/g sample和0.93±0.13 mg GALAEs/g sample;醇提物的阳性当量值分别为0.22±0.04 mmol ACEs/g sample、5.23±0.45 mg AREs/g sample、0.05±0.001 mg GALAEs/g sample和1.87±0.08 mg GALAEs/g sample。

表3 黄姜花花提取物的酶抑制活性

2.5 黄姜花花提取物的抗炎活性

2.5.1 黄姜花花提取物细胞毒性

如图8所示,黄姜花花醇提物在500 μg/mL对RAW 264.7细胞表现出促增殖作用,黄姜花花水提物浓度在250 μg/mL及以下时对RAW 264.7细胞无毒性。与空白组相比,在黄姜花花醇提物和水提物的浓度范围为31.25～250 μg/mL时对RAW 264.7细胞存活率的影响不显著(P>0.05),所以后续试验选择浓度为62.5、125、250 μg/mL。

图8 黄姜花花提取物对RAW 264.7细胞存活率的影响

2.5.2 黄姜花花提取物促炎症介质和细胞因子释放量测定

如图9所示,将RAW 264.7细胞用LPS诱导后,模型组NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量与空白对照相比显著提高(P<0.05),使用提取物(62.5、125、250 μg/mL)预处理RAW 264.7细胞后,NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量均低于模型组。尤其是浓度为250 μg/mL的醇提物对NO、PGE2、TNF-α和IL-6的影响均优于地塞米松(20 μg/mL),而对IL-1β的影响相当于地塞米松(20 μg/mL)。此外浓度为250 μg/mL的水提物对PGE2和IL-6的作用优于地塞米松(20μg/mL)。以

图9 黄姜花花提取物对RAW 264.7细胞促炎介质和细胞因子释放量的影响

上结果表明,黄姜花花提取物可显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中促炎症介质和细胞因子的释放,并且呈剂量依赖性。

3 讨论与结论

植物多酚和黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、增强免疫力、抗菌消炎、改善心血管、保护肝脏、抗衰老、降血脂、抗癌等作用[15],而黄姜花花提取物总酚酸总黄酮含量较高,可以用作酚类和黄酮类的丰富来源。从黄姜花花提取物中共鉴定出58种化合物,包括11种酚类化合物和18种黄酮类化合物。黄姜花花提取物对DPPH和ABTS自由基都有较好的抗氧化活性,特别是对DPPH自由基的清除作用较强。在过去的研究中发现,植物提取物的总酚和类黄酮含量与其对DPPH和ABTS的清除能力呈正相关性[16,17],所以黄姜花花提取物较强的抗氧化能力与其较高的总酚酸和总黄酮含量密不可分。

黄姜花花醇提物和水提物都能显著降低RAW 264.7细胞中促炎症介质(NO和PGE2)和细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的过度分泌,其中醇提物表现出更好的抗炎活性。据研究报道,松柏醛具有较好的抗炎作用,可减轻炎症损伤[18];异槲皮苷可抑制TNF-α、NO、iNOS和COX-2的过度产生[19];槲皮素可降低炎症细胞因子TNF-α、IL-1β的释放量[20];香叶木素具有抗炎作用[21]。以上化合物只存在于醇提物中,这些化合物可能是黄姜花花醇提物抗炎活性较好的原因。除此之外,两种提取物都含有的丁香醛有抗炎作用[22];香草酸可抑制细胞因子的产生,用于治疗炎症[23];七叶亭可抑制炎症相关介质合成,减轻炎症反应[24,25];维采宁II可抑制细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β产生[26]。因此,黄姜花花提取物的抗炎作用可能与其中酚类和黄酮类化合物的生物活性相关。

综上所述,黄姜花花水提物和醇提物含有较高含量的酚类和黄酮类化合物,有较好的抗氧化活性抑制能力和一定的酶抑制能力,同时表现出较好的抗炎作用。研究结果可为黄姜花的花在食品、药品、化妆品等领域的开发利用提供理论基础。