不同干燥方法对合欢花药材化学成分及其抗氧化活性影响

左亚锋,徐秀泉,李巧月,王孟虎,孟祥松*,闫 攀,金传山,吴德玲*

1亳州学院中药学院;2亳州学院 中药原料产品研发安徽普通高校重点实验室,亳州 236800;3安徽中医药大学药学院,合肥 230012

合欢花为豆科植物合欢(AlbiziajulibrissinDurazz.)的干燥花序或花蕾,前者称“合欢花”,后者称“合欢米”,其性甘,平,归心、肝经,具有解郁安神功效[1]。合欢花药用历史悠久,始载于《神农本草经》,历代本草对其解郁安神之功效应用均有记载[2]。现代研究表明合欢花含有槲皮苷、槲皮素等大量黄酮类成分[3,4]和少量多糖、挥发油类等活性成分,具有抗抑郁、镇静催眠、抗焦虑、保肝和抗氧化等多种药理作用[5]。

合欢花中含有大量黄酮苷类成分,苷类化合物易受酶的作用而水解,而含苷的中药往往也含有可水解该苷的酶。干制是新鲜合欢花产地采摘后必需的初加工过程,不同的干燥初加工过程可能会激活或抑制酶的活性,导致活性物质在酶的作用下水解或保存,从而引起合欢花药材品质的变化[6,7]。“杀青”是通过一定方法将采收后植物体内相关酶进行灭火的方法。“杀青”方法在中药材初加工中应用广泛,合适的“杀青”方法可以破坏新鲜植物体内酶活性,有利于保留活性物质,影响着药材的性状和品质[8]。合理的干制初加工方式对合欢花药材中黄酮苷类成分的保留发挥重要作用,合欢花传统的干燥方法为晒干[2],传统晒干方法受自然环境影响较大,不同规格合欢花外观形态差异较大,合欢花和合欢米通用晒干方式是否合适尚不明确。

因此本研究以合欢花和合欢米为研究对象,比较传统干燥方法(晒干、阴干)、不同杀青干燥方法(蒸汽杀青后烘干、微波杀青后烘干)、烘干(30、50、70、90 ℃)和冷冻干燥方法对2种规格合欢花药材中关键活性物质和抗氧化活性的影响,为合欢花类药材的产地加工及利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司,配置SPD-M20A型紫外可见光检测器);A01-10NA0848型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司);UV-1900i紫外可见分光光度计(岛津仪器(苏州)有限公司);XPR2型1/100万电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),FA2104B分析天平(上海越平科学仪器有限公司);SpectraMax iD3型酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司)。

1.2 材料与试剂

2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)(上海源叶生物科技有限公司,批号:B25609-20 mg);2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)(上海源叶生物科技有限公司,批号:S19198-5 g);1,10-菲洛啉(上海源叶生物科技有限公司,批号:S19172-25 g);邻苯三酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,P104235-100 g);异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素对照品(成都普菲德生物技术有限公司,批号分别为MUST-21041613、MUST-21080502、MUST-2203310,纯度均≥98%);乙腈、甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

合欢花采摘于安徽省亳州市亳州学院校园内,经安徽中医药大学金传山教授鉴定为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的新鲜花序及花蕾。将新鲜合欢花和合欢米通过晒干(D1)、阴干(D2)、蒸汽杀青后烘干(D3)、微波杀青后烘干(D4)、30 ℃烘干(D5)、50 ℃烘干(D6)、70 ℃烘干(D7)、90 ℃烘干(D8)、冷冻干燥(D9)九种干燥方法进行干燥,干燥后样品置于置通风干燥处保存备用。

1.3 方法

1.3.1 合欢花药材的干燥处理

摘取新鲜合欢花药材,按照外观形态分为花蕾型(合欢米AlbiziajulibrissinDurazz.flower bud,AJFB)和盛开型(合欢花AlbiziajulibrissinDurazz.flower,AJF)2种规格(见图1)。取新鲜合欢花样品,均匀分成9份。取新鲜合欢花于干净托盘中,放置于阳光下干燥得到晒干样品;取新鲜合欢花于干净托盘中,放置于房间阴凉处通风干燥,及时翻动,得到阴干样品;取新鲜合欢花于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到冷冻干燥样品;取新鲜合欢花于蒸汽锅中杀青4 min,取出置干净托盘中,然后在50 ℃烘箱中烘干得到蒸汽杀青后烘干样品;取新鲜合欢花于微波炉(700 W)中杀青4 min,取出置干净托盘中,然后在50 ℃烘箱中烘干得到微波杀青后烘干样品;取新鲜合欢花于干净托盘中,分别于30、50、70、90 ℃烘箱中干燥得到30、50、70、90 ℃烘干样品;取新鲜合欢米样品,均匀分成9份,按照上述合欢花样品方法干燥,样品均需干燥至含水量≤15%[1]。将干燥后样品粉碎过三号筛(50目,355±13 μm),放干燥器中密封保存备用。

图1 不同规格合欢花药材

1.3.2 总黄酮含量测定

参照文献总黄酮含量测定方法[9]测定样品中总黄酮含量。

1.3.3 槲皮苷、槲皮素、异槲皮苷含量测定

1.3.3.1 对照品溶液的制备

分别精密称定槲皮苷对照品10.05 mg、异槲皮苷对照品6.02 mg、槲皮素对照品6.03 mg置于10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解至刻度,定容,配成质量浓度分别为1.005、0.602、0.603 mg/mL的混合对照品溶液。

1.3.3.2 供试品溶液的制备

精密称取合欢花粉末(过三号筛)约2.0 g,放置于具塞锥形瓶中,然后加甲醇40 mL溶解并称定质量,超声处理40 min(40 kHz、300 W)取出放冷至室温后,用甲醇补足失重。先摇匀然后用滤纸滤去残渣,取上清液10 mL置于蒸发皿中,水浴(50 ℃)浓缩,加90%甲醇使溶解并定容至100 mL容量瓶中,用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液[10]。

1.3.3.3 色谱条件

Welch Ultimate Polar RP色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);甲醇(A)～0.1%磷酸水溶液(B)进行梯度洗脱(0～5 min,60%A;5～10 min,50%A→45%A;10～20 min,45%A→40%A;20～30 min,40%A→35%A;30～40 min,35%A→90%A;40～45 min,90%A→60%A;45～55 min,60%A)[11];检测波长为360 nm;流速1 min/mL;柱温为35 ℃;进样量为10 μL,合欢花药材样品溶液和混合对照品溶液HPLC色谱图(见图2)。

图2 混合对照品溶液(A)和样品溶液(B)的HPLC色谱图

1.3.3.4 方法学考察

精密吸取“1.3.3.1”项下混合对照品工作液,按“1.3.3.3”项下色谱条件测定,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标,进行线性回归得回归方程(见表1)。

表1 3种黄酮类成分的线性关系

精密吸取“1.3.3.1”项下混合对照品工作液,连续进样6次,计算异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.35%、0.030%、0.050%,表明仪器精密度良好。

取晒干合欢花样品供试品溶液,按“1.3.3.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定,计算异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.7%、0.14%、1.8%,表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。

精密称取晒干合欢花样品粉末6份,按照“1.3.3.2”项下方法制备供试品溶液,按照“1.3.3.3”项下色谱条件进样测定。计算异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面积的RSD分别为2.3%、0.56%、1.1%,表明该方法的重复性良好。

取已知含量的晒干合欢花样品(每1 g样品中含异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的量分别为1.75、16.45、0.145 mg)粉末6份,每份约1.0 g,精密称定,分别加入混合对照品溶液(每1 mL分别含有异槲皮苷0.182 3 mg、槲皮苷1.638 5 mg和槲皮素15.20 μg)10 mL和甲醇溶液30 mL,按“1.3.3.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.3.3.3”项下色谱条件测定,计算加样回收率及RSD值,各成分异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素回收率分别为100.2%、100.0%、99.24%,RSD值分别为2.2%、0.29%、4.3%,表明方法较为准确可靠。

1.3.3.5 样品含量测定

分别精密吸取不同干燥处理合欢花药材样品的供试品溶液,按“1.3.3.3”项下色谱条件测定异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素含量。

1.3.4 抗氧化活性测定

1.3.4.1 Fe3+还原能力测定

参考文献方法测定样品Fe3+还原能力[8]。取1 mL供试品溶液(生药质量浓度为5 mg/mL)加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和2.5 mL K3Fe(CN)6(1%,W/W)溶液中,50 ℃反应20 min。冷却后,加入2.5 mL三氯乙酸(10%,W/V),离心(3 500 g)10 min。将上清液(2.5 mL)与蒸馏水(2.5 mL)和新鲜制备的FeCl3溶液(1 mL,0.1%,W/W)混合,取混合液200 μL置于96孔板中,在700 nm处立即记录吸光度。按公式计算Fe3+还原能力:R=A1-A0,式中,R越大表明样品的还原能力越强,A1为加入样品后吸光度,A0为空白对照组吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力参考文献测定[12-14]。取供试品溶液(生药质量浓度为5 mg/mL)1 mL与3 mL DPPH(0.1 mmol/L)混合,将混合物摇匀,避光条件下室温保存30 min,取混合液200 μL置于96孔板中,然后在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率计算公式:I=[1-(A2-A1)]/A0× 100%。式中,I表示清除率,A2为含空白溶剂的样品溶液,A1为含自由基工作溶液的样品溶液,A0为含有自由基工作溶液的空白溶剂。

1.3.4.3 ABTS自由基清除能力测定

ABTS自由基清除能力参考文献测定[15,16]。将7 mL ABTS(7 mmol/L)与88 μL K2S2O8(140 mmol/L)混合,黑暗反应14～16 h,得到ABTS工作溶液。然后用乙醇稀释,在734 nm处测得的吸光度为0.70±0.02。然后,取0.2 mL供试品溶液(生药质量浓度为5 mg/mL)和8.8 mL ABTS工作溶液完全混合,在避光条件下室温混合15 min。在734 nm处测定吸光度。ABTS自由基清除率计算公式:I=[1-(A2-A1)]/A0× 100%。式中,I表示清除率,A2为含空白溶剂的样品溶液,A1为含自由基工作溶液的样品溶液,A0为含有自由基工作溶液的空白溶剂。

1.3.4.5 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力参照文献测定[19,20],首先用1,10-菲洛啉法绘制FeSO4标准曲线,Y=1.329 7X-0.018 3(R2=0.999 5),然后精密移取系列稀释100倍供试品溶液(生药质量浓度为5 mg/mL)1 mL,0.2% FeCl3乙醇溶液1 mL,0.5% 1,10-菲洛啉乙醇溶液500 μL,置于10 mL容量瓶中定容至刻度,黑暗处反应放置20 min。以1 mL 95%的乙醇为空白对照,将样品放置于96孔板中,然后在510 nm处测定吸光度。将测得的吸光度数值代入上述标准曲线方程,计算不同样品Fe2+当量,Fe2+浓度越高,表明样品具有越强的还原Fe3+为Fe2+的能力。

1.3.5 黄酮类成分与抗氧化活性相关性分析

将不同干燥处理合欢花药材的各化学成分标准化值分别与抗氧化活性标准化值进行Spearman相关性分析。

1.3.6 数据统计

2 结果与分析

2.1 合欢花药材黄酮类成分测定

2.1.1 总黄酮类成分含量测定

总黄酮在不同干燥的合欢花药材样品中的含量(见图3)。晒干、阴干、蒸汽杀青后烘干、90 ℃烘干、冷冻干燥对合欢花中总黄酮含量影响有显著差异(P<0.05),其中蒸汽杀青后烘干样品总黄酮含量最高,微波杀青后干燥和70 ℃烘干、30 ℃烘干和50 ℃烘干对合欢花中总黄酮含量影响无显著性差异,阴干的合欢花样品中总黄酮含量最低。与晒干的合欢米样品中总黄酮含量相比,其他干燥处理均显著提高总黄酮含量(P<0.05),冷冻干燥处理的合欢米样品中总黄酮含量最高。

图3 不同干燥方法处理的2种规格合欢花药材中总黄酮含量

2.1.2 异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素含量测定

为综合评价合欢花药材的品质,测定干燥样品中异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素等成分的含量(见图4)。蒸汽杀青后烘干的合欢花样品中异槲皮苷和槲皮苷含量最高,而槲皮素含量则较低。阴干的合欢花样品中异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素含量都显著较低(P<0.05)。冷冻干燥的合欢米样品中异槲皮苷含量显著最高(P<0.05),其次是70、50 ℃、蒸汽杀青后烘干样品。30 ℃烘干和阴干样品,晒干、微波杀青后烘干和90 ℃烘干样品中异槲皮苷含量无显著性差异。冷冻干燥的合欢米样品中槲皮素含量较低,槲皮苷含量在冷冻干燥、微波杀青后烘干和30 ℃烘干条件下变化不显著,但含量显著高于其他干燥方法(P<0.05)。晒干的合欢米样品中异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素含量都显著较低(P<0.05)。

图4 不同干燥方法处理的2种规格合欢花药材中3种黄酮类成分含量

2.2 抗氧化活性

表2 不同干燥方式处理后2种规格合欢花类药材的抗氧化活性

2.3 不同干燥处理的合欢花药材化学质量特征综合评价

2.3.1 主成分分析PCA

表3 主成分的特征值及方差贡献率

表4 因子载荷矩阵

表5 不同干燥方法样品的主成分得分及其综合评价

不同干燥方法对2种规格合欢花药材影响显著,综合评分表明盛开的合欢花适合宜采用70 ℃烘干处理,花蕾期的合欢米宜采用冷冻干燥处理。阴干的合欢花样品综合得分最低,晒干和阴干的合欢米样品综合得分也排名靠后,综合评分表明阴干和晒干可能对合欢花和合欢米质量造成一定损失。

2.3.2 聚类分析CA

通过系统聚类分析可进一步揭示了样品之间的差异和联系(见图5),样品之间平方欧氏距离较长,对应的相似性较低,差异越大[21]。

图5 不同干燥方式处理后合欢花(A)和合欢米(B)的聚类分析

聚类分析显示,不同干燥处理的所有合欢花样品均可归入4个聚类。将晒干、50 ℃烘干、70 ℃烘干、蒸汽杀青后烘干、微波杀青后烘干和30 ℃烘干处理的合欢花样品聚为一类,50 ℃烘干和70 ℃烘干样品、蒸汽杀青后烘干和微波杀青后烘干样品特别接近,说明它们具有相似的理化和抗氧化性能。将经30 ℃烘干处理的合欢花样品分为第2类,阴干样品分为第3类,冷冻干燥样品分为第4类。冷冻干燥样品距离其他干燥方式样品最远,说明其与其他干燥方式差异最大。不同干燥处理的所有合欢米样品均可归入3个聚类。晒干、阴干、50 ℃烘干、蒸汽杀青后烘干和微波杀青后烘干处理的合欢米样品聚为一类,70 ℃烘干和90 ℃烘干样品聚为第2类,30 ℃烘干和冷冻干燥样品分为第3类。这可能是由于合欢米在这些干燥过程中的化学反应和转化途径导致,这说明合欢米代谢产物的活性成分和抗氧化能力存在明显差异。合欢米样品的3个聚类距离差明显小于合欢花的,表明干燥方法对合欢米样品质量的影响差异小于合欢花样品。

2.3.3 黄酮类成分与抗氧化活性相关性分析

2种规格合欢花类药材的化学物质和抗氧化性能是质量归属的关键。因此,为了解释它们随不同干燥处理的变化,我们进行活性成分含量与抗氧化活性的相关性分析。本研究中各变量之间的相关性不是线性的,且不完全满足方差齐性的条件[22],同时为了避免由极值产生的虚假相关性[23],采用SPSS中Spearman相关系数检验分析来揭示2种规格合欢花类药材活性化合物与抗氧化活性之间的相互关系(见表6)。

表6 不同干燥处理样品黄酮类成分与抗氧化活性相关性分析

3 讨论与结论

本文研究传统干燥方法(晒干、阴干)、杀青干燥方法(蒸汽杀青后烘干、微波杀青后烘干)、烘干(30、50、70、90 ℃)和冷冻干燥对2种规格合欢花药材品质影响。建立HPLC法测定异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素含量,采用紫外可见分光光度法测定总黄酮含量,比较不同干燥处理合欢花药材黄酮类成分含量差异。不同干燥处理的合欢花药材黄酮类成分含量差异显著。与传统干燥方法相比,蒸汽杀青后烘干合欢花样品总黄酮含量、异槲皮苷、槲皮苷含量均显著较高,而槲皮素含量较低。冷冻干燥合欢米样品中总黄酮和异槲皮苷含量显著最高,蒸汽杀青后烘干样品槲皮苷含量显著最高。合适的“杀青”方法可以破坏新鲜植物体内酶活性,保留活性物质,此时透力较强的蒸汽杀青方法即能破坏细胞结构并抑制水解酶的活性,降低黄酮苷类成分的水解;冷冻干燥的过程中水分能直接从固态升华为气态除去,低温干燥可抑制水解酶的活性,也有利于活性成分的保存[24]。

合欢花中黄酮类成分异槲皮苷、槲皮苷及槲皮素为2种合欢花药材中主要活性成分,具有明显的抗氧化作用[25-27]。本文采用5种抗氧化方法来评价合欢花类药材质量及其对不同自由基的清除活性,由于选择的5种抗氧化方法实验原理各不相同,可客观综合评价2种合欢花药材抗氧化活性。实验结果表明不同干燥处理合欢花药材样品抗氧化活性结果存在显著差异。相关性分析进一步表明,槲皮苷与DPPH自由基清除能力、Fe3+还原能力、总抗氧化能力呈显著正相关(P<0.05),ABTS自由基清除能力与总黄酮含量呈极显著正相关(P<0.01),槲皮素含量与ABTS自由基清除能力呈显著正相关(P<0.05),总黄酮含量和槲皮苷含量呈显著正相关,槲皮苷含量可作为总黄酮含量大小的评价指标,推测槲皮苷和槲皮素是2种合欢花类药材主要抗氧化活性物质。