不同产地甘草中核苷和碱基类成分分析与评价

谢明霞,朱正清,陈 思,杜 可,王 芷,郭东卫,王汉卿

1湖南中医药大学,长沙 410208;2湖南省脑科医院(湖南省第二人民医院),长沙 410021;3宁夏医科大学,银川 750004

中药甘草始载于《神农本草经》,来源于豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFishch.、胀果甘草G.inflatBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎[1],为药食同源之品。据报道,市售90%以上的甘草药材其基原植物为甘草G.uralensisFishch.[2]。现代药理研究表明,甘草具有抗病毒、抗炎、保肝、抗糖尿病、抗肿瘤等活性[3]。化学研究表明,甘草中主要含有黄酮类、三萜类、苯丙素类及多糖等成分,目前共计分离获得了244个化合物[4]。“诸药所生,皆有其境”强调了生态环境对药材品质影响,基于此,研究不同生境下药材中化学成分差异,对于评价药材质量,保障其疗效具有重要意义。野生和栽培甘草由于所受外界环境胁迫不同,课题组前期研究结果显示,二者之间淀粉、纤维等大分子物质及芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸等黄酮、三萜皂苷类成分存在差异[5,6]。针对不同产地甘草中化学成分的研究,课题组报道了基于非靶标代谢组学结合化学计量学可以区分不同产地甘草[7]。核苷类成分是生命中必不可少的物质,是细胞的重要组成部分,是新陈代谢的核心[8-9]。核苷类似药物在人类健康中起着关键作用,这些小分子药物参与病毒或癌细胞生命周期中DNA或RNA复制过程中酶的相互作用,使其用于抗病毒、抗癌、抗菌等[10]。全面分析植物提取物中核苷类成分是研究植物中核苷的有效途径[11]。然而,目前尚缺乏对甘草中核苷、碱基类成分的研究,对于不同产地甘草中核苷、碱基类成分是否存在差异,进而影响其疗效尚未见报道。

本研究采用UPLC-TQ/MS测定不同产地甘草中核苷、碱基类成分含量,并基于其含量数据,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)分析不同产地甘草差异,为其合理开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC系统(Waters公司);Xevo TQ-S质谱仪(Waters公司);MassLynxTM XS 质谱工作站(Waters公司);BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);Milli-Q超纯水系统(默克密理博公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 材料

甘草药材采自宁夏、甘肃、内蒙古和新疆四个产区,采集三年生甘草的根和根茎,晒干,共计153批次,包括宁夏45个样本、甘肃26个样本、内蒙古61个样本、新疆21个样本,经宁夏医科大学药学院生药系王汉卿教授鉴定为甘草GlycyrrhizauralensisFishch.的根及根茎。

化学对照品:鸟嘌呤(Gua)(批号BCBM438 0V)、胸苷(Thyd)(批号041M0151)、2′-脱氧胞苷(2′-dC)(批号AF9033002)、腺嘌呤(Ade)(批号SLBF5824)、次黄嘌呤(Hyp)(批号SLBD4750)、尿苷(Uri)(批号SLBD3297)、胞苷-5′-环磷酸(C-5′P)(批号SLBH2408V)、黄嘌呤(Xan)(批号SLBD5517)、胞苷(Cytd)(批号BCBL5271)、鸟苷(Guad)(批号SLBF4484)、胞嘧啶(Cyt)(批号SLBF0582)、胸腺嘧啶(Thym)(批号WXBB0684)均购于Sigma公司,纯度≥98%。色谱级乙腈和甲酸购于德国默克公司,超纯水由Milli-Q超纯水仪自制,其他试剂均为国产分析纯。

2 方法和结果

2.1 供试品溶液制备

精密取甘草样品粉末(过50目筛)约0.5 g,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入20 mL水,室温超声提取(100 kHz)30 min,补足减失重量,13 000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm滤膜,续滤液备用。

2.2 对照品溶液制备

分别取各对照品适量,精密称定,加水配制成混合对照品储备溶液,Gua、Thyd、2′-dC、Ade、Hyp、Uri、C-5′P、Xan、Cytd、Guad、Cyt、Thym浓度分别为297.6、188.6、191.8、402.2、314.2、582.6、154.0、296.0、200.4、243.8、346.0、206.8 μg/mL的混合对照品储备液,上述储备液稀释制成不同浓度的对照品溶液。

2.3 色谱条件

参照文献方法[12]:ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相A为5 mmol/L甲酸铵、5 mmol/L乙酸铵和0.2%的甲酸水溶液,流动相B为1 mmol/L甲酸铵、1 mmol/L乙酸铵和0.2%的甲酸乙腈溶液;梯度洗脱(0～3 min,10%A;3～9 min,10%→18%A;9～15 min,18%→20%A;15～16 min,20%→46%A;16～18 min,46%A);流速0.4 mL/min;柱温20 ℃,进样体积1 μL。

2.4 质谱条件

多反应检测(MRM),电喷雾离子源采用正离子模式(ESI+),毛细管电压:3.0 kV,离子源温度150 ℃,脱溶剂气温度550 ℃,脱溶剂气流量1 000 L/h;锥孔气流量50 L/h;碰撞气流量0.15 mL/min,所测成分锥孔电压和碰撞能力与MRM匹配。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系、检出限和定量限

取“2.2项”下不同浓度的混合对照品溶液,按2.3项色谱条件进行测定,以各对照品离子流峰面积(y)与其浓度(μg/mL,x)绘制标准曲线,得线性回归方程和相关系数r。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别以信噪比(S/N)为3和10计算。结果见表1,LOD和LOQ分别为1.18～9.96 ng/mL和3.82～28.98 ng/mL,可以用于定量分析。

表1 方法学考察

2.5.2 精密度、重复性、稳定性试验

精密度试验:取同一混合对照品溶液,按“2.3项”色谱条件和“2.4项”质谱条件连续进样6次,测定各成分峰面积,计算相对标准偏差(RSD)。结果见表2,12种核苷、碱基峰面积的RSD值均<5.0%,表明仪器精密度良好。

重复性试验:取供试样品宁夏产6号样本,按“2.1项”平行制备供试品溶液6份,按“2.3项”色谱条件和“2.4项”质谱条件测定峰面积,计算各测定成分峰面积的RSD。结果见表2,表明该方法重复性良好。

稳定性试验:取供试样品宁夏产6号样本,按“2.1项”制备供试品溶液,按“2.3项”和“2.4项”条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定峰面积,计算峰面积RSD值。结果见表2,表明供试品样品在24 h内稳定。

2.5.3 加样回收率试验

取已知各成分含量的样品宁夏产6号样本约0.5 g,精密称定,根据样品中各成分含量的80%、100%和120%分别加入对照品,按“2.1项”制备供试品溶液,按“2.3项”色谱条件和“2.4项”质谱条件测定峰面积,计算回收率。结果见表2,回收率在94.32%～103.9%,RSD值<5.0%,表明该方法准确度良好。

2.6 不同产地甘草中核苷和碱基含量测定

本研究共测定了12种核苷、碱基类成分,其中包括5种核苷(Thym、2′-dC、Uri、Cytd、Guad)、6种碱基(Gua、Ade、Hyp、Xan、Cyt和Thym)和1种核苷酸(C-5′P),色谱图见图1,含量测定结果见图2,不同产地甘草中核苷和碱基含量差异采用Duncan′s多重比较分析。测定样品的核苷、碱基类总含量为31.84～38.17 mg/100 g,不同产地甘草中核苷、碱基类总含量宁夏>甘肃>内蒙古>新疆,宁夏与甘肃产甘草中核苷、碱基类成分总含量显著高于内蒙古和新疆产甘草(P<0.05)。分析各核苷、碱基类成分含量,结果显示:(1)甘草中核苷类成分以Cytd最高,Guad次之,二者的含量分别为5.001～11.185 8 mg/100 g和2.014～8.824 8 mg/100 g,二者含量占核苷、碱基类总含量的26.2%～47.8%;Thyd和2′-dC的含量相对较低,其中Thyd的含量低于0.5 mg/100 g、2′-dC的含量低于1 mg/100 g。比较不同产地甘草之间核苷类成分含量差异,五种核苷类成分在不同产地甘草中含量存在显著差异(P<0.05),均呈现为甘肃最高,其中Cydt、Guad和Uri在不同产地甘草中的含量变化趋势基本一致,内蒙古和新疆产甘草中的含量显著低于甘肃和宁夏(P<0.05)。(2)甘草中碱基类成分以Ade和Gua含量较高,含量分别为2.003～7.595 5 mg/100 g和2.554 4～7.737 0 mg/100 g,二者含量占核苷、碱基类总含量的19.3%～38.7%;其余四种碱基的含量均低于1 mg/100 g。比较不同产地甘草之间碱基类成分含量差异,六种碱基的含量均存在显著差异(P<0.05),但不同产地间含量变化趋势不同。其中Gua、Hyp和Xan均以宁夏和内蒙古产甘草中含量较高,Gua和Xan以甘肃显著低于其他产区(P<0.05),Xan含量在甘肃和新疆产甘草中无显著差异(P>0.05);Ade含量新疆>甘肃≈宁夏>内蒙古;Cyt在内蒙古产甘草中的含量显著高于宁夏和甘肃(P<0.05);Thym以内蒙古产甘草中含量最高,其他三个产区无显著差异(P>0.05)。综合考虑碱基类成分,宁夏和内蒙古产甘草中含量较高。(3)研究中仅检测到了C-5′P一种核苷酸,其含量为2.349 7～9.856 9 mg/100 g,占总核苷、碱基含量的6.1%～28.2%。各产地甘草中C-5′P的含量为新疆>甘肃>宁夏>内蒙古,其中新疆与内蒙古产甘草中含量差异显著(P<0.05)。综上可知,不同产地甘草中核苷、碱基类成分含量变化并不一致,评价其质量差异需综合考虑各成分含量变化及占比。

图1 核苷和碱基类UPLC-TQ/MS色谱图

图2 不同产地甘草中核苷、碱基含量

2.7 PCA和PLS-DA分析

为分析不同产地甘草中核苷、碱基类成分特征,基于测定12种核苷、碱基含量,对153批次甘草进行主成分分析(PCA),结果显示,前两个主成分(PC1和PC2)累计贡献率达54.8%,各产地甘草样本间形成了聚类趋势,但不能将各产地样本明确区分(见图3A)。为进一步确定各产地样本间是否存在差异,对153批甘草样本进行偏最小二乘(PLS-DA)判别分析,模型结果显示,R2Y为0.53,Q2为0.501,均大于0.5,代表模型准确率较高,PLS-DA判别结果见图3B。由图可知,不同产地的甘草可以分为两组,第一组(Ⅰ)产自宁夏和内蒙古,第二组(Ⅱ)产自甘肃和新疆。VIP图分析结果显示(见图3C),Gua、Ade、Uri、Cytd和Guad的VIP>1,为不同产地甘草中主要差异的核苷和碱基类成分。

图3 不同产地甘草中核苷、碱基类成分PCA和PLS-DA分析

PLS-DA判别分析将不同产地甘草区分为两组,其中宁夏和内蒙古产区地理位置接近,被划分为了同一组;而甘肃主产区和新疆产区地理位置则较为接近,被划分为另外一组。为进一步判定各组内不同产地之间甘草中核苷、碱基类成分特征,再次采用PLS-DA分别分析组Ⅰ和组Ⅱ中甘草样本,结果见图4。PLS-DA分析甘肃和新疆样本,判别模型显示R2Y和Q2分别为0.948和0.939,接近于1,表明模型准确率高,得分图显示(见图4A),二者可以完全区分。双坐标(Biplot)图(见图4B)显示,Ade、C-5′P、Xan、Gua和Cyt与新疆样本的相关性较高,而Thyd、Thym、Hyp、2′-dC、Guad、Cytd和Uri则与甘肃样本的相关性较高。进一步采用VIP图分析二者主要的差异成分显示(见图4C),Uri、Cytd、Guad和Ade的VIP值>1,为主要差异成分。宁夏和内蒙古样本的PLS-DA分析结果显示,判别模型的R2Y和Q2分别为0.565和0.454,Q2<0.5,模型相对较差。同时得分图显示(见图4D),基于核苷和碱基类成分,PLS-DA并不能完全区分宁夏和内蒙古样本,表明两个产地的核苷、碱基类成分含量一致度较高,样本较为相似。

图4 不同组内甘草中核苷、碱基类成分PLS-DA分析

3 讨论与结论

中药材质量是保障临床用药安全和有效的基础,除遗传因素外,环境和人为等因素均可引起质量差异。道地药材形成逆境效应理论[13]的提出表明了环境胁迫对药材质量的影响。药材产地不同,其所受的环境因素不同,进而影响其质量,如已有研究表明,不同产地半边莲[14]、陈皮[15]、白芍[16]等药材质量存在差异。课题组前期研究结果表明,不同产地甘草中黄酮、三萜类等次生代谢产物存在差异[7]。然而,目前对不同产地药材的质量差异的研究多侧重于次生代谢物,对于其初生代谢产物,如氨基酸、核苷、碱基等成分的研究报道较少。本研究基于甘草中初生代谢物核苷、碱基类研究不同产地甘草质量差异,研究结果显示,不同产地甘草中核苷、碱基类成分含量为31.84～37.83 mg/100 g,与枸杞子[17]中的含量相近,低于菊花中核苷、碱基的总含量(61.13～555.45 mg/100 g)[18],但高于茯苓中核苷、碱基类成分的总含量(6.23～10.28 mg/100 g)[19],由此可见,甘草中核苷、碱基类成分含量在药食同源中药材中处于中等水平。基于四个产地样本的PLS-DA判别结果显示,宁夏和内蒙古样本聚为一类,甘肃和新疆样本聚为另外一类,分析其可能原因,甘草产地经历了从甘肃等地到宁夏、内蒙古等地的变迁[20],且从地理位置判断,甘草在甘肃和新疆的主产区的地理位置较为接近,而内蒙古和宁夏地理位置较为接近,地理位置相近的产区环境因子、生产加工等均较为相似,进而促进了药材质量特征的一致性。进一步的PLS-DA判别分析结果显示,甘肃和新疆样本可以区分,其可能原因是二者的主产区虽都属于大陆性气候,但在地形地貌、无霜期等方面依然存在差异,进而导致了药材中化学成分的积累差异。不同产地间主要的差异成分为Gua、Ade、Uri、Cytd和Guad,其中Gua可以通过控制基因转录作为一种连接生长和细胞能量状态的因子[21];Ade在免疫和炎症反应中发挥着重要作用[22];Uri和Guad作为中枢神经系统的调节分子,可以调节大脑中的不同生理和病理过程[23];由此可知,以上差异性成分具有一定的生理、药理活性,其成分含量差异可能导致活性差异,进而影响其高效、合理利用。

本研究采用UPLC-TQ/MS测定了不同产地甘草中12种核苷、碱基类成分含量。研究结果显示,不同产地甘草中核苷、碱基类总含量存在显著差异(P<0.05),且基于测定的核苷、碱基含量,采用PLS-DA判别分析可以将甘草样本进行产地划分,其中宁夏和内蒙古产的甘草中核苷、碱基类成分最为相似,各产地间主要的差异成分为Gua、Ade、Uri、Cytd和Guad。研究结果为揭示不同产地甘草质量存在差异提供了理论支持,为其合理开发利用奠定了基础。