不同栽培品种柑橘橘皮黄酮类成分含量及抗氧化活性比较研究

王海帆,王 鹏,王 福,陈 林,陈鸿平,胡 媛,刘友平

成都中医药大学药学院 西南特色中药资源国家重点实验室,成都 611137

柑橘在我国已有四千多年栽培历史,宋代柑橘已有几十个品种,《橘录》载:“柑品有八,有朱柑、乳柑……;橘品十有四,有黄橘、朱橘……”。近年来为追求柑橘果肉的食用价值及经济效益,又出现了大量橘栽培新品种,如甘平、青见、明日见等[1]。可见柑橘从古至今均有多品种的特点,其果皮入药也亦有记载。《神农本草经》[2]中首次记载了陈皮来源为芸香科柑橘属宽皮橘类多种栽培品种的果皮。2020年版《中国药典》一部陈皮项下[3]规定陈皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。特别注明了4种柑橘入药品种,茶枝柑C.reticulata‘Chachi’(广陈皮)、大红袍C.reticulata‘Dahongpao’、温州蜜柑C.reticulata‘Unshiu’、福橘C.reticulata‘Tangerina’。可见柑橘虽有多个品种,但其果皮药用价值有所不同。2002年,卫生部颁布“卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知卫法监发[2002]51号”,印发新的“既是食品又是药品的物品名单”中规定橘皮为食药两用物质[4]。如今柑橘皮作为药食两用物质,不仅仅面临品种选择问题。随着柑橘种植面积加大,柑橘加工业兴起所产生副产品果皮,有些以“杂陈皮”[5]流通于市场,有些作为废弃物掩埋。不同柑橘果皮的应用价值研究滞后,导致其应用现状混乱,其药食两用价值利用不合理,不充分问题突出。

2020年版《中国药典》一部陈皮项下[3]对于陈皮药材的质量控制,只规定了橙皮苷含量限度,有一定局限性。黄酮类化合物作为柑橘橘皮中主要活性成分之一,具有改善糖脂代谢、保护心血管、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性[6]。罗美霞[7]等研究就表明以橙皮苷和多甲氧基黄酮中含量较高且差异较大的川陈皮素和橘皮素为多指标成分进行陈皮质量综合评价更科学、全面,且川陈皮素和橘皮素具有预防肥胖、辅助降血脂、抗炎的作用[8,9]。虽已有研究表明不同品种柑橘皮黄酮含量有明显差异[10],但并未与2020年版《中国药典》陈皮项下规定的入药品种做对比。故本研究以9种柑橘果皮为研究对象,测定总黄酮,化学性质比较稳定、便于提取分离、含量较高且生物活性明确的5种黄酮类成分(芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素及橘皮素)及抗氧化活性并进行聚类分析及TOPSIS分析,以期为橘皮药食两用价值评价提供一定参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司);U-T1800型双光束紫外可见分光光度计(上海屹谱仪器制造有限公司);CP2000型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司);Varioskan flash型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);UPTUO-I-1000TE优普系列超纯水机(成都纯水科技有限公司)。

1.2 材料

橙皮苷(批号:wkq22010509,纯度:98%)、甜橙黄酮(批号:wkq22051711,纯度:98%)(成都埃法生物科技有限公司);芸香柚皮苷(批号:RFS-Y07102206023,纯度:98%)、橘皮素(批号:MUST-21083014,纯度:98%)、川陈皮素(批号:MUST-20041210,纯度:98%)(成都曼思特生物科技有限公司);甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯,美国TEDIA天地试剂公司);95%乙醇(分析纯,成都临江化工厂);甲醇(分析纯,成都市科隆化学品有限公司)。

样品均经成都中医药大学药学院药用植物学教研室严铸云教授鉴定为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)栽培品种的干燥成熟果皮(见表1)。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备

精密称取橙皮苷对照品0.10 mg,加甲醇制成1 mL 0.10 mg的溶液作为对照品储备液[11]。

2.1.2 供试品溶液制备

将橘皮样品粉碎,过4号筛,称取橘皮样品粉末约0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密量取甲醇30 mL,称重,超声提取30 min,称重,用甲醇补足重量,过滤,收集滤液,甲醇定容至50 mL即得[11]。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密称取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶,以甲醇为空白,在285.5 nm处测定吸光度,以吸光度(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程[11]:Y=47.029X-0.0497,R2=0.9996,在0.008～0.0 016 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 样品中总黄酮的含量测定

取不同品种柑橘橘皮,按“2.1.2”项下,制备溶液,在285.5 nm处测定吸光度,根据线性回归方程计算不同品种柑橘橘皮中总黄酮含量,结果见表2。总黄酮含量范围为34.8～69.3 mg/g,不同品种之间,DHP和CLU总黄酮含量显著高于AY38、CJ、WG、GP(P< 0.05)。

表2 不同栽培品种柑橘橘皮总黄酮含量测定

2.2 主要活性成分含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素和橘皮素对照品适量,置5 mL容量瓶中,加甲醇溶解定容,混匀,得到浓度分别为0.264、0.57、0.066、0.126、0.08 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取不同品种橘皮样品粉末(过4号筛)约0.5 g,精密称定,加30 mL 70%甲醇,超声(500 W,30 kHz)30 min,放冷,称重,用70% 甲醇补重,过滤,取续滤液过0.22 μm微孔滤膜,即得。

2.2.3 色谱条件

采用Boston Green ODS C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相:0.1%甲酸溶液为流动相A,乙腈溶液为流动相B,梯度洗脱(0～10 min,20%→30%B;10～20min,30%→50% B;20～30min,50%→60% B;30～35min,60%→90% B;35～40min,90%→100% B,40～50 min,100%→20% B);流速为0.7 mL/min;柱温为30 ℃;检测波长为332 nm;进样量为10 μL;检测器为紫外(DAD)检测器[12]。混合对照品溶液及橘皮样品溶液的HPLC色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液(A)及样品溶液(B)HPLC色谱图

2.2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL,分别进样,记录HPLC色谱图。

以进样量(x,μL)为横坐标,以峰面积(y)为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程,结果见表3。

表3 不同栽培品种柑橘橘皮中主要活性成分线性回归方程及线性范围

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 精密度试验

在 “2.2.3” 色谱条件下,对同一对照品溶液重复6次进样,进样量10 μL,计算芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素峰面积的RSD值分别为0.13%、0.45%、2.5%、0.19%、0.37%,表明仪器精密度良好。

2.2.5.2 重复性试验

取同一批橘皮6份,制备成供试品溶液,在“2.2.3”色谱条件下进样,计算芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素峰面积的RSD值分别为1.5%、1.0%、0.53%、0.19%、1.0%,表明方法重复性良好。

2.2.5.3 稳定性试验

取橘皮供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h,按“2.2.3”色谱条件下进样,计算芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素和橘皮素峰面积的RSD值分别为2.2%、1.7%、2.2%、3.7%、0.050%,表明芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素和橘皮素在24 h内稳定性良好。

2.2.5.4 回收率试验

取一批橘皮样品6份,精密称定,加入适量对照品溶液,按“2.2.2”项方法制备供试品溶液,按 “2.2.3” 项下色谱条件进样测定并计算芸香柚皮苷、橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素和橘皮素平均回收率分别为102.3%、97.49%、98.43%、97.66%、98.37%,RSD值分别为1.1%、2.5%、2.3%、2.5%、1.7%。

2.2.5.5 样品含量测定

取不同品种橘皮样品,按 “2.2.2” 项下制备样品溶液,按“2.2.3”项下色谱条件进样测定,根据外标一点法计算不同品种橘皮中5种黄酮类成分含量,结果见表4。

表4 不同栽培品种柑橘橘皮黄酮类成分含量

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 供试品溶液的制备

按照 “2.2.2” 项下的方式制备供试品原液,再分别稀释6倍及8倍。

2.3.2 DPPH溶液的配制

精密称取DPPH 2.02 mg,置于50 mL容量瓶中,加95%乙醇溶解,定容,摇匀,即得DPPH溶液(浓度为0.040 4 mg/mL)。

2.3.3 ABTS溶液的配制

将ABTS配制成6.94 mmol/L水溶液,将K2S2O8配制成2.6 mmol/L水溶液,在使用前将二者混合溶液置于阴凉处12～16 h,使两者发生完全充分的反应。然后用95%乙醇稀释原溶液,在波长734 nm处检测,直到最终测得的吸光度值在0.70±0.02之间,即完成ABTS+溶液的配制[13]。

2.3.4 DPPH清除率计算

96孔板加入样品后置于阴暗处反应1 h后使用Varioskan Flash酶标仪测定OD值,测定波长选择517 nm。DPPH清除率计算公式如下。

式中:A0表示100 μL DPPH溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值;A1表示100 μL DPPH溶液+100 μL供试品;A2表示100 μL供试品溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值。

由表4可知,不同栽培品种柑橘橘皮醇提取物对DPPH自由基清除能力具有一定差异。其中,CJ对DPPH自由基的清除能力最高,CLU对DPPH自由基的清除能力最低。

2.3.5 ABTS清除率计算

96孔板加入样品后置于阴暗处反应40 min后使用Varioskan Flash酶标仪测定吸光度OD值,测定波长选择750 nm。ABTS清除率计算公式如下。

式中:A0表示25 μL 95%乙醇+175 μL ABTS+的吸光度值;A1表示25 μL样品+175 μL ABTS+的吸光度值;A2表示25μL样品175 μL 95%乙醇的吸光度值。

由图2可知,不同栽培品种柑橘橘皮醇提取物对DPPH自由基清除能力具有一定差异。其中,CJ对DPPH自由基清除能力最高,CLU对ABTS自由基的清除能力最高。

2.4 多元统计法分析不同栽培品种橘皮的质量差异

2.4.1 聚类分析

将上述8个指标经归一化处理后作为评价指标,采用迈维云平台(https://cloud.metware.cn/#/home)绘制聚类热图,详见图3。结果显示,9种样品可以划分为3类:DHP、PK、AY38为第Ⅰ类,该类样品中以川陈皮素和橘皮素的含量相对较高;CLU、CJ、WG为第Ⅱ类,该类样品中以芸香柚皮苷的含量相对较高;CJ、GP、MRJ为第Ⅲ类,该类样品中化合物含量及抗氧化能力相对较弱;对比各类样品的热图颜色深浅,发现第Ⅰ类样品相对Ⅱ、Ⅲ类样品颜色更红,表明第Ⅰ类样品的综合质量相对较好。

图3 不同栽培品种柑橘橘皮8个指标聚类热图

2.4.2 熵权TOPSIS分析

以不同栽培品种柑橘橘皮中8个指标的数据为原始数据,建立初始决策矩阵,计算出每个指标的权重系数,选出最优方案与最劣方案,然后计算每个样品与最优解的欧氏贴近度Ci 并进行排序[14,15]。结果显示,样品 DHP、PK、AY38的综合得分较高(分别为0.663、0.600、0.540),而CJ、MRJ和GP的综合得分较低(分别为0.307、0.220和0.198),这提示样品DHP、PK、AY38的综合质量相对较好,CJ、MRJ和GP的综合质量相对较差,该结果与聚类分析结果基本一致。结果见表5。

表5 不同栽培品种柑橘橘皮综合质量评分排序结果

3 讨论与结论

大红袍红橘(DHP)总黄酮含量及抗氧化能力与温州蜜柑(CLU)、椪柑(PK)、青见(QJ)及明日见(MRJ)差异不显著,其中CLU及QJ橙皮苷含量显著高于DHP。在食品工业中,柑橘果皮凭借其强抗氧化性而被应用于各个方面,例如橘皮提取物可作为猪肉天然保鲜剂[16],可作为具抗氧化性的柑橘果冻功能食品[17]。未作药用的CLU、PK、QJ及MRJ均可作为天然抗氧化剂提取来源。黄酮类化合物中橙皮苷含量超过黄酮含量的50%,并且具有抗炎、抗氧化、抑菌、调控脂质代谢等生理功能[18],且单体是应用于对抗SARS-CoV2病毒最有效的抗菌剂[19],也有制成橙皮苷透皮纳米制剂治疗普通假单胞菌[20]及橙皮苷纳米颗粒处理环境有机污染物[21]。实验结果表明CLU及QJ可为提取橙皮苷提供原材料。

聚类热图分析通过对复杂数据进行筛选、提取和降维,可快速、全面地对样品进行鉴别和归类,并将结果直观地展现出来[22]。熵权TOPSIS法是一种多指标的决策分析方法,现已被广泛用于中药材的质量评价中[23]。将这2种方法结合起来应用,可更加科学、全面、客观地评价药材质量。聚类热图分析结果显示,9种橘皮被划分为3类,并且第Ⅰ类样品(DHP、PK、AY38)的质量优于第Ⅱ～Ⅲ类样品。同时,本研究以熵权TOPSIS 法建立了陈皮药材的整体质量评价模型,结果显示,样品 DHP、PK的综合得分排序在前2位,提示其质量相对较好。上述分析方法相互结合、互为补充,分析结果相互印证,能较全面地评价陈皮药材的质量。结合总黄酮含量测定结果:大红袍红橘(DHP)总黄酮含量显著高于爱媛38号(AY38)、春见(CJ)、沃柑(WG)及甘平(GP)(P< 0.05),最终得出PK与DHP黄酮类化学成分及抗氧化活性相接近,有作为药用栽培品种的潜力,与文献研究结果一致[5]。

综上,本研究对9种橘皮黄酮类化学成分及抗氧化活性进行比较分析,发现DHP、CLU、PK、QJ及MRJ均可作为天然抗氧化剂提取来源,CLU及QJ可为橙皮苷化合物提取提供原料,为柑橘果皮副产物产品开发提供参考。9个不同栽培品种橘皮中PK与DHP黄酮类化学成分及抗氧化活性接近,有作为药用栽培品种的潜力,为目前不同栽培品种橘皮混杂入药提供参考。但本研究只重点测定了9种栽培品种橘皮中黄酮类指标成分的含量,成分类别和样品批次相对较少。在后续研究中,可增加样品批次,并综合生物碱类、多糖类及挥发油类等多个类别的成分进行分析,以更加全面地评价橘皮的药食两用价值。