基于网络药理学及体外实验探究野蚕豆根抗氧化活性及其作用机制

刘鑫澜,朱朋艳,马金蓉,王星月 ,韦 茜,高艳梅,张冬英*,袁文娟*

1云南农业大学食品科学技术学院;2云南农业大学理学院,昆明 650201;3云南省红河州食品药品检验所,蒙自 661199

野蚕豆根,为玄参科(Scrophulariaceae)胡麻草属(Centranthera)植物大花胡麻草(CentrantheragrandifloraBenth)的根,主要分布在云南、贵州、广西等地[1,2]。野蚕豆根为药食同源类植物,富含多种活性物质,如环烯醚萜、苯乙醇苷、紫罗兰酮、类胡萝卜素、单萜等多类化合物[3,4],具有抗氧化、抗炎、抗凝血和心肌缺血以及促进伤口愈合等生理活性[5-7]。古籍记载用其泡酒,来防治脑血栓、脑梗等疾病[8]。在云南被当作彝族药材种植,广泛用于民族医药。目前的研究主要集中在野蚕豆根的提取分离,以及活性研究[9]。野蚕豆根富含环烯醚萜苷类物质,具有抗氧化、降脂保肝以及预防心脑血管疾病的功效[10,11],具有很大的开发潜力。

氧化应激是指机体受到刺激,造成体内产生过多的活性氧(reactive oxygen species,ROS),导致与抗氧化物的失衡,从而引起的一种应激状态[12],能够引发心血管疾病、神经系统疾病和癌症等[13]。由于加工合成的抗氧化剂会对健康产生潜在的危害,因此人们更加致力于去寻求天然的抗氧化剂[14,15]。天然抗氧化剂具有疗效显著、毒副作用较低等特点[16],越来越受到人们关注。野蚕豆根作为一种天然药物,具有良好的抗氧化活性,但关于其具体的活性成分及作用机制研究较少。

网络药理学是从系统层面揭示药物在机体中的调节网络的一门新兴学科。通过构建“药物、活性成分、靶点、疾病”之间的复杂网络关系,可以预测药物的作用机制,尤其适用于中药开发的多靶点药物的作用机制预测[17]。本文借助网络药理学分析了野蚕豆根的主要活性成分及成分靶点,深入探讨其抗氧化作用的分子机制,并通过体外抗氧化实验以及生物学手段进行了验证,为深入开展野蚕豆根基础实验研究提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 数据库与软件

TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss target prediction数据库(http://www.Swisstargetprediction.ch)、PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt数据库(https://www.uniprot.org)、OMIM数据库 (https://www.omim.org)、Genecards 数 据 库 (https://www.genecards.org)、VENNY 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)、微生信在线平台 (http://www.bioinformatics.com.cn)、STRING数据库(https://cn.string-db.org)、蛋白质结构数据库 (https://www.alphafold.ebi.ac.uk)、Cytoscape 3.8.0、AutoDockTools 1.5.7、PyMOL。

1.1.2 实验试剂与仪器

野蚕豆根采自云南省屏边县和平乡镇,由云南省红河州食品药品检验所高艳梅老师鉴定为玄参科胡麻草属植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth的根。C2C12小鼠成肌细胞(云南农业大学普洱茶教育部重点实验室细胞库);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(批号:CU6GJC-ZG)、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(批号:C15513541)、RIPA裂解液(批号:20230309)(索莱宝生物公司);兔抗PI3K抗体(货号:4249S)、p-PI3K抗体(货号:17366S)、AKT抗体(货号:9272S)、p-AKT抗体(货号:4060S)(CST公司);胎牛血清(批号:1010D053,美国赛默飞世尔科技公司);PVDF膜(批号:A30683441,Millipore公司);脱脂奶粉(批号:D6340,BD公司);VC(批号:1007101)、水杨酸(批号:20191101)、硫酸亚铁(批号:20201011)、无水乙醇(批号:20230701)、过硫酸钾(批号:20190103)(分析纯,天津大茂化学试剂厂)。

BSA224W-CW型万分之一电子天平(Sartorius公司);CO2气体培养箱(BINDER公司);超净工作台(AIRTECH公司);Multiskan Mk3型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 野蚕豆根体外抗氧化实验验证

1.2.1.1 野蚕豆根提取物的制备

将1 kg干燥的野蚕豆根药材研磨成粗粉,用60%的乙醇,在温度为50℃下超声提取1 h,重复3次,后减压浓缩得到浸膏337.5 g,留存备用。

精密称取野蚕豆根提取物(the extract ofC.grandifloraBenth roots,CGE)适量,用乙醇溶解并稀释到一定体积,制成浓度依次为10、20、40、80、160、320 μg/mL的溶液用作抗氧化活性研究。

1.2.1.2 DPPH法测定抗氧化活性

精密吸取100 μL不同浓度的野蚕豆根提取物溶液(10、20、40、80、160、320 μg/mL)和100 μL 0.3 mmol/L DPPH无水乙醇溶液,放入96孔板中,经均匀混合后,于37 ℃下,避光保存30 min,在波长517 nm处检测吸光值A1。用100 μL无水乙醇溶液代替DPPH溶液测得吸光值A2。同时测得100 μL DPPH的无水乙醇溶液和100 μL无水乙醇溶液在该条件下的吸光值Ad。采用VC作为阳性对照。每份样品平行实验3次。DPPH自由基清除率(R)按公式(1)进行计算。

R=[1-(A1-A2)/Ad]×100%

(1)

1.2.1.3 ABTS法测定抗氧化活性

精密吸取100 μL不同浓度的野蚕豆根提取物溶液(10、20、40、80、160、320 μg/mL)和100 μL ABTS工作液,置96孔板中,经均匀混合后,于37 ℃下,避光保存30 min,在波长734 nm处检测吸光值A3。用100 μL水代替ABTS工作液测得吸光值A4。同时测得100 μL ABTS工作液和100 μL水的混合液在该条件下的吸光值Aa。采用VC作为阳性对照。每份样品平行实验3次。ABTS自由基清除率(R)按公式(2)计算。

R=[1-(A3-A4)/Aa]×100%

(2)

1.2.1.4 清除羟自由基能力测定

精密吸取100 μL不同浓度的野蚕豆根提取物溶液(10、20、40、80、160、320 μg/mL)放入96孔板中,同时加入浓度为6.0 mmol/L硫酸亚铁溶液和10.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各100 μL,再加6.0 mmol/L的H2O2溶液100 μL,置于37 ℃下,避光放置10 min,在波长510 nm下检测吸光度A5。蒸馏水作为样品对照A6,样品溶剂作为空白对照Ao。以VC作阳性对照。每个样品平行实验3次。羟自由基清除率(R)按公式(3)计算。

R=[1-(A5-A6)/Ao]×100%

(3)

1.2.2 野蚕豆根抗氧化机制的网络药理学预测

1.2.2.1 药物成分潜在靶点预测

在TCMSP数据库以及知网、万方和PubMed等平台进行文献检索,挖掘出野蚕豆根中的化学成分。从Pubchem网站中下载这些化合物的Smile格式,然后在Swiss target prediction数据库中,以物种 “Homo sapiens”,以Probability>0.01为条件筛选成分靶点。利用Uniprot数据库规范与作用成分相关的靶点蛋白,获得靶点对应的基因名[18]。

1.2.2.2 疾病分子靶点预测

通过OMIM数据库、GeneCards数据库,输入“oxidative”检索相关靶点,去重汇总后得到氧化应激的相关作用靶点。将野蚕豆根的成分靶点和氧化应激的作用靶点利用Venny 2.1.0作韦恩图,获得共同靶点。

1.2.2.3 蛋白互作网络分析

在STRING数据库上对得到的交集靶点进行可视化分析。在过滤条件为“Homo sapiens”的情况下,得到了蛋白互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)。借助Cytoscape 3.8.0分析获得的PPI网络数据信息,使用拓扑学方法并根据度值(degree centrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)来确定核心靶点[17]。

1.2.2.4 GO和KEGG分析

利用cluster Profiler等R语言,进行交集靶点的基因本体(Gene Ontology,GO)分析以及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。一般选取P值<0.01的GO、KEGG项目,来进行显著分析[18]。利用Cytoscape 3.8.0软件,构建野蚕豆根的“活性成分-作用靶点-通路”图。

1.2.2.5 分子对接

利用PubChem数据库,对野蚕豆根中的化学成分中进行检索,下载对应3D结构的SDF文件。在蛋白质结构数据库中下载靶蛋白结构的PDB文件。然后利用AutoDock 1.5.7软件对靶点蛋白等进行去水、加氢等修饰,之后进行分子对接以及计算最小结合能。用Affinity(kcal/mol)值,来评价结合能力。Affinity数值越低,代表配体与受体结合越稳定。之后再通过Pymol进行可视化操作。

1.2.3 野蚕豆根抗氧化作用机理验证

1.2.3.1 细胞培养

将C2C12细胞复苏后,在含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液进行培养观察。当细胞生长状态到80%左右,用0.25%胰蛋白酶消化传代。之后在含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中进行培养换液,根据细胞状态及密度定期进行换液或传代。

1.2.3.2 蛋白免疫印迹法(Western blot)验证

取对数生长期C2C12细胞,接于60 mm细胞培养皿中,设置成6组,即:空白对照组、VC阳性对照组(10 μg/mL)、过氧化氢模型组(600 μmol/L H2O2)、野蚕豆根提取物低、中、高(200、300、400 μg/mL)剂量组。造模和用药时,模型组更换为含有H2O2的培养基,野蚕豆根提取物组为低、中、高处理组的培养基预处理20 h,再更换为含有H2O2的培养基处理4 h。

用RIPA缓冲液在冰上裂解不同组的C2C12细胞,在裂解液中提取总蛋白,然后使用BCA定量。后经10% SDS-PAGE电泳,在PVDF膜上进行转移,使用5%脱脂牛奶进行封闭操作。TBST洗膜后,在4 ℃摇床上孵育一抗PI3K(1∶750)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶500)、β-tublin(1∶2 000) 16～24 h。TBST洗膜3次,每次5 min,随后室温下加入HRP标记的兔抗(1∶5 000)孵育1 h。TBST洗膜3次,每次5 min;加入ECL发光液,分别采用全自动成像分析系统和Image J软件进行显影和分析。以β-tublin为内参,分析相关蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 野蚕豆根体外抗氧化实验验证

2.1.1 DPPH法测定抗氧化活性

由图1A可知,野蚕豆根提取物溶液和VC溶液的DPPH自由基清除能力均随浓度增加而增强,且VC溶液的清除能力较好。随着浓度的增加,野蚕豆根提取物溶液的DPPH自由基清除能力在逐步接近VC溶液。在80 μg/mL后,清除能力显著增加。在320 μg/mL时野蚕豆根提取物溶液的清除能力较强,清除率为73.86%。同时,经拟合计算得到野蚕豆根提取物溶液对DPPH自由基的IC50值为0.166 mg/mL,表现出较强的抗氧化活性。

2.1.2 ABTS法测定抗氧化活性

由图1B可知,野蚕豆根提取物溶液和Vc溶液的ABTS自由基清除能力均随浓度增加而增强,浓度在10～320 μg/mL范围时清除率与提取液和Vc浓度呈正相关。在320 μg/mL时,野蚕豆根提取物溶液的清除率达到83.89%。同时,经拟合计算得到野蚕豆根提取物溶液对ABTS自由基的IC50值为0.054 mg/mL,表现出较强的抗氧化活性。

2.1.3 羟自由基清除能力

由图1C可知,野蚕豆根提取物溶液和VC溶液对羟自由基都有着较好的清除效果。可以看出浓度在10～80 μg/mL范围内,野蚕豆根提取物溶液表现出和VC溶液接近的清除能力。浓度在80 μg/mL后,野蚕豆根提取物溶液和VC溶液的清除能力都随着浓度显著增加。在320 μg/mL时,野蚕豆根提取物溶液的清除率59.15%。虽然野蚕豆根提取物溶液对羟自由基的清除能力相对较低,但是其仍能达到60%左右的清除率,可表明其是一种清除羟自由基的有效成分。同时,经拟合计算得到野蚕豆根提取物对羟自由基的IC50值为0.180 mg/mL,表现出较强的抗氧化活性。

2.2 野蚕豆根活性成分与靶点

通过TCMSP数据库以及文献检索,去除无效成分后,筛选得到了22个野蚕豆根活性成分(见表1)。同时获得了86个活性成分的作用靶点。

表1 野蚕豆根的活性成分信息

2.3 野蚕豆根抗氧化应激靶点的获取

在OMIM数据库、GeneCards数据库中,共筛选得到了14 187个氧化应激的疾病靶点。将其与86个药物活性成分靶点取交集,构建韦恩图(见图2),共得到82个交集靶点。

图2 野蚕豆根活性成分与氧化应激交集靶点

2.4 药物分子-疾病靶点PPI网络构建

运用STRING数据库,对野蚕豆根治疗氧化应激的82个交集靶点进行蛋白互作分析,构建PPI网络,并在Cytoscape3.8.0中进行可视化分析(见图3)。结果共获得75个节点和212条节点之间的连线。节点是野蚕豆根与氧化应激交集靶点编码的蛋白,节点间的连线即为度(degree)。节点的连线越多,表示相互作用越多,靶点的作用越重要[17]。图中圆形面积越大表示其相连的靶点越多,度值越高。为了进一步筛选PPI网络中的核心靶点蛋白,在Cytoscape3.8.0中对PPI网络的节点进行拓扑学分析,选择出大于DC、BC、CC中位数的目标值。共得到STAT3、HSP90AA1、HDAC1、PPARG等23个核心靶点(见表2)。

表2 PPI网络核心靶点

图3 蛋白-蛋白互相作用图

2.5 GO和KEGG富集通路分析

对野蚕豆根治疗氧化应激的82个交集靶点进行GO富集分析。GO分析包括生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3个部分。结果共得到了3 386个GO富集条目,其中有2 847个条目与生物过程方面有关,188个条目与细胞组成方面相关、351个条目与分子功能方面有关。由P值从小到大,排列出每个部分的前10个条目(见图4)。在生物过程方面,野蚕豆根主要参与细胞内受体信号通路(intracellular receptor signaling pathway)、核苷生物合成过程(nucleoside biosynthetic process)、糖基化合物代谢过程(glycosyl compound metabolic process)、RNA聚合酶ll启动子的转录起始(transcription initiation from RNA polymerase ll promoter)、糖基化合物生物合成过程(glycosyl compound biosynthetic process)等过程。在细胞组成方面,野蚕豆根主要作用于细胞质囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、富含纤维胶凝蛋白-1的颗粒管腔(ficolin-1-rich granule lumen)、囊泡腔(vesicle lumen)、溶酶体腔(lysosomal lumen)、富含纤维胶凝蛋白-1的颗粒(ficolin-1-rich granule)等部位。在分子功能方面,野蚕豆根主要富集在碳水化合物结合(carbohydrate binding)、核受体活性(nuclear receptor activity)、转录辅激活因子结合(transcription coactivator binding)、单糖结合(monosaccharide binding)、配体活化转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)等。

图4 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共富集到了相关通路211条。由P值进行排序,筛选出排名前10名的通路,并作出气泡图(见图5)。结果显示,野蚕豆根抗氧化应激的作用靶点主要富集在PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化学致癌-受体激活(chemical carcinogenesis-receptor activation)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism)、脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)等通路。

图5 KEGG信号通路富集分析

2.6 野蚕豆根“活性成分-作用靶点-通路”网络的构建

为了进一步探究作用机制,构建了野蚕豆根“活性成分-作用靶点-通路”图(见图6)。结果可见,野蚕豆根内单一活性成分可作用多个靶点,不同的靶点也会包含于不同的活性成分中,且参与多条通路。说明野蚕豆根可能通过多成分、多靶点、多通路调控和抑制氧化应激的发生。

图6 野蚕豆根“活性成分-作用靶点-通路”网络

2.7 分子对接验证

为进一步明确野蚕豆根抗氧化应激的活性成分与关键靶点之间的结合效应,选取了部分活性成分与“活性成分-靶点-通路”网络中前3个的关键靶点STAT3、HDAC1及HSP90AA1进行分子对接(见表3)。通常认为,分子对接结合能小于0时说明两分子具有自发结合能力,分子对接结合能小于-1.2 kcal/mol时则表明两分子结合良好[17]。结果显示,所有对接的活性成分与靶点均具有良好的结合活性。杜鹃红素和β-谷甾醇的结合能最低,其中杜鹃红素为野蚕豆根中的特征性成分,因此在Pymol软件中选取杜鹃红素完成可视化分析,分析具体结合情况(见图7)。

表3 作用成分与核心靶点对接的结合能

图7 杜鹃红素与靶蛋白的分子对接过程

2.8 Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达

在本次实验中,采用体外抗氧化模型已验证了野蚕豆根具有较好的抗氧化活性。同时,通过KEGG通路富集,发现PI3K/Akt信号通路与野蚕豆根抗氧化应激密切相关。因此采用Western blot对PI3K-Akt通路的相关蛋白的表达进行检测。结果显示,与过氧化氢模型组相比,野蚕豆根提取物低、中、高处理组细胞中 p-PI3K和p-Akt(Ser473)的表达水平均被显著上调(P<0.05)(见图8),起到抗氧化作用。

图8 野蚕豆根提取物对关键蛋白表达的影响

3 讨论与结论

野蚕豆根是我国的一种传统中药,含有环烯醚萜类、苯乙醇类、类胡萝卜素类等多种活性物质,具有抗氧化、降糖、抗凝血和心肌缺血等多种药理活性。目前,对于野蚕豆根抗氧化活性的研究也在逐渐深入,但关于其具体的活性成分和机制还尚未发掘。为了进一步探究野蚕豆根抗氧化应激的作用机制,本文借助体外抗氧化实验、网络药理学、分子对接技术以及Western blot检测对其进行进一步研究。

通过体外抗氧化实验,发现了野蚕豆根提取物具有DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的清除能力,且在一定浓度范围内,野蚕豆根提取物的三种自由基清除率具有一定的线性关系。在浓度为320 μg/mL时,3种自由基的清除率分别为73.86%、83.89%、59.15%,IC50值分别为0.166 mg/mL、0.054 mg/mL 和0.180 mg/mL,表现出良好的抗氧化能力。

通过文献以及相关数据库的筛选,得到了22个野蚕豆根的活性成分,包括桃叶珊瑚苷、杜鹃红素、β-谷甾醇、栀子新甙甲酯、梓醇等。其中桃叶珊瑚苷在野蚕豆根中含量最高,具有抗氧化、抗菌、抗癌等广泛的活性[19]。Nrf2是抗氧化应激的核心转录因子,调控下游抗氧化因子的激活和表达,维持细胞稳态[20]。有研究发现桃叶珊瑚苷可通过Nrf2介导的抗氧化途径来抑制小鼠破骨细胞的分化,从而减缓骨质疏松的发展[21]。杜鹃红素是一种天然的类胡萝卜素,是野蚕豆根中的重要活性成分。研究发现,野蚕豆根中的杜鹃红素可以通过增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性等,来发挥对细胞氧化应激损伤的保护作用。同时,还可以通过激活Nrf2-ARE通路,起到对心肌损伤的保护活性[5]。梓醇是也是一类环烯醚萜苷类的化合物,具有抗炎、抗氧化等广泛的药理活性。研究发现,梓醇还可通过上调Nrf2和HO-1的表达,增加SOD的活性,降低MDA的活性,减少脑细胞凋亡的发生,促进Bcl-2蛋白的表达,抑制Bax蛋白的表达,减轻氧化应激损伤[22]。

在蛋白互作网络分析中,获得了野蚕豆根活性成分抗氧化应激的82个作用靶点。主要包括STAT3、HSP90AA1、HDAC1、PPARG、HSPAB1等23个核心靶点。热休克蛋白(HSPs)是一种分子伴侣蛋白,它可以改变其他蛋白质的结构和相互作用,并由热休克和其他化学和物理应激诱导[23]。HSP90AA1和HSP90AB1同属于HSPs中的HSP90家族。当发生氧化应激时,会激活细胞内热休克蛋白的表达。研究发现,HSP90可通过调节Keap1(INrf2)-Nrf2信号途径来调节机体的氧化损伤。在氧化应激的状态下,HSP90会与Keap1发生相互反应,促使Keap1与Nrf2复合物的解离,从而释放Nrf2。通过Nrf2及其下游蛋白的转录激活来保护细胞免受氧化应激[24,25]。STAT3是氧化应激后细胞存活的重要介导因子,具有强大的增殖作用和凋亡抵抗作用[26]。研究表明,STATA3可以通过上调抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达以及促进caspases的失活,来发挥其细胞保护作用[27,28]。HDAC1是一类催化组蛋白和非组蛋白去乙酰化的酶,能够通过组蛋白和转录因子的去乙酰化降低抗氧化酶的表达[29]。同时有研究发现,抑制HDAC1的表达可以通过改善细胞活力以及增加SOD活性等,防止化学缺氧诱导的H9c2细胞氧化应激失衡[30]。

KEGG富集分析表明野蚕豆根发挥抗氧化能力主要与PI3K/Akt信号通路、核苷酸代谢通路、雌激素信号通路等有关。其中PI3K/Akt信号通路在抗氧化应激中有着重要地位它广泛存在于哺乳动物中细胞中,具有良好的神经保护性。PI3K/Akt信号通路的激活将促进Akt级联的磷酸化,防治氧化损伤[31]。研究表明,通过调控PI3K/Akt信号通路,可以改善软骨细胞以及H9c2心肌细胞的凋亡和氧化应激[32,33]。

分子对接结果显示,野蚕豆根的活性成分与核心靶点间存在良好的结合效应,其相互结合能力较强,作用密切。

PI3K属于细胞质脂类激酶。当PI3K磷酸化的同时,会招募并引起Akt的磷酸化,从而调控氧化应激、凋亡等生理活动[31]。Western blot检测结果发现,野蚕豆根正丁醇提取物能够促进蛋白PI3K以及Akt的磷酸化,从而激活PI3K/Akt信号通路,改善氧化应激。

综上所述,本文采用体外抗氧化实验对野蚕豆根的抗氧化活性进行了评价。借助网络药理学、分子对接技术对野蚕豆根抗氧化应激的活性成分、作用靶点、信号通路等进行了预测。最后利用Western blot检测对其作用机制加以验证。结果表明,野蚕豆根提取物清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的IC50值分别为0.166、0.054和0.180 mg/mL,验证了其具有良好的抗氧化活性。网络药理学结果显示,野蚕豆根可通过多成分、多靶点、多通路来改善氧化应激,其中PI3K/Akt信号通路可能是其发挥抗氧化作用的关键通路。Western blot检测进一步发现,野蚕豆根提取物可通过促进PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的磷酸化从而激活该通路,发挥抗氧化活性,进而验证了野蚕豆根抗氧化应激的作用机制,为野蚕豆根在抗氧化应激作用的深入研究上提供了方向以及奠定了基础。