一测多评法测定石菖蒲中β-细辛醚、α-细辛醚的含量

赵俊赫 霍志鹏 连玉姣 邱守昊 王 玉 张依倩▲

1.天津中医药大学，天津 301617；2.天士力医药集团股份有限公司研究院 现代中药创制全国重点实验室，天津 300410

石菖蒲为天南星科石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根茎，性辛、苦、温，归心、胃经[1]，具有开窍豁痰、醒神益智、化湿开胃的功效，为开窍醒脑要药[2-4]。石菖蒲中挥发性成分主要为β-细辛醚、α-细辛醚[5-7]，具有抗肿瘤、抗炎、抗癫痫、抗血栓、抗焦虑、抗癫痫、保护心脑血管等作用[8-13]。但石菖蒲药材的主要活性成分β-细辛醚对照品价格昂贵，且对照品溶液不易配制。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by singlemarke，QAMS）可以通过选择一个成分为内标物，实现多个成分的定量分析，可减少成分定量分析的时间与成本，弥补对照品不足的问题，具有方便、易于操作等优点[14]。因此，本试验尝试以α-细辛醚为内标，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）计算α-细辛醚与β-细辛醚的相对矫正因子，建立QAMS测定石菖蒲中β-细辛醚、α-细辛醚的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Waters e2695-2998型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；昆山舒美KQ-500DE超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；XS-205DU电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

石菖蒲药材（批号：20190101，安徽省永香中药饮片有限公司）；β-细辛醚（天士力控股集团有限公司研究院），α-细辛醚（批号：L1913066，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色谱甲醇、色谱乙腈（德国默克公司）；无水乙醇（天津康科德科技有限公司）；超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱 为Agilent Eclipse XDB C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流动相：0.05%磷酸水（A）-乙 腈（B），梯 度 洗 脱：0～28 min，35%～42%B；28～31 min，42%～90% B；31～34 min，90%～35% B。流速：1 ml/min；柱温30℃；进样体积10 μl；检测波长254 nm。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图（254 nm）

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 称取石菖蒲药材粉末（过4号筛）0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称重，超声15 min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，过滤，取续滤液，过0.2 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取对照品β-细辛醚、α-细辛醚适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为92.20、21.32 μg/ml混合对照品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验 取空白溶剂（甲醇）、2.2项下制备的各溶液按2.1项下色谱条件分别进样、测定，观察各个待测物与对照品出峰时间是否一致。结果表明β-细辛醚、α-细辛醚两成分与相邻色谱峰均能达到分离，分离度均≥1.5，拖尾因子≤1.5，分离良好，且与对照品出峰时间一致。

2.3.2 精密度试验 取2.2项下配置的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，测定待测组分的峰面积，计算其RSD。β-细辛醚峰面积的RSD为1.04%，α-细辛醚峰面积的RSD分别为1.09%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.3 线性关系考察 精密称取β-细辛醚、α-细辛醚对照品适量，加甲醇配成浓度依次为461.00、106.62 μg/ml的混合对照品溶液，作为线标溶液a，依次用甲醇稀释2、4、8、16、32倍，制成β-细辛醚230.50、115.25、57.63、28.81、14.41 μg/ml，α-细辛醚53.31、26.66、13.33、6.66、3.33 μg/ml的混合对照品溶液，作为线标溶液b～f。依次精密吸取线标溶液a～f各适量，按2.1项下色谱条件分别进样，记录峰面积，以质量浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，并计算相关系数。β-细辛醚线性回归方程为Y=30270.0X-4283.3，线 性范 围14.41～461.00 μg/ml，α-细 辛 醚 的线性回归方程为Y=44 614.8X-6967.2，线性范围3.33～106.62 μg/ml，R2均为0.9999，表明两成分线性关系良好。

2.3.4 稳定性试验 取混合对照品溶液与同一份供试品溶液，分别于溶液制配制后0、2、4、8、12、16、24 h，按2.1项下色谱条件进样，测定待测组分的峰面积，计算对照品溶液与供试品溶液中β-细辛醚和α-细辛醚峰面积的RSD。对照品溶液中β-细辛醚和α-细辛醚峰面积的RSD均为1.05%，供试品溶液中β-细辛醚和α-细辛醚峰面积的RSD分别为0.61%和0.56%。结果表明对照品溶液与供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 取同一批次的石菖蒲药材粉末适量，按2.2项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录待测组分的峰面积，分别计算各成分含量。β-细辛醚和α-细辛醚含量平均值分别为20.1655 mg/g和5.5680 mg/g，RSD分别为0.94%和0.97%（n=6），结果表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率 取已知含量的石菖蒲药材粉末适量，研细，取6份，每份约0.1 g，精密称定，分别加入精密称定的β-细辛醚对照品2.0440 mg，α-细辛醚对照品0.5468 mg，按2.2项下供试品溶液制备方法平行制备加标溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算β-细辛醚和α-细辛醚的加样回收率及RSD值。β-细辛醚和α-细辛醚的平均加样回收率分别为98.69%和100.24%，RSD分别为2.04%和2.06%。

2.4 待测组分色谱峰的定位

采用相对保留时间（t）对色谱峰进行定位，即t待测组分/内标=t待测组分/t内标，计算不同仪器和不同色谱柱条件下β-细辛醚与α-细辛醚的相对保留时间平均值为0.8723，RSD为0.31%，结果见表1，结果表明不同品牌仪器及色谱柱检测所得目标峰的相对保留时间没有明显的差异。

表1 两种成分的相对保留时间

2.5 相对校正因子的测定和计算

取2.3.3项下混合对照品溶液a～f各适量，按2.1项下色谱条件依次进样，记录两种成分的峰面积，以α-细辛醚为内标，按照相对校正因子计算公式fis=fi/fs=（mi×As）/（ms×Ai）计算α-细辛醚对β-细辛醚的校正因子，其中i为某化合物，s为内标物，m为质量，A为峰面积。计算所得相对校正因子平均值为1.4572，RSD为1.26%，结果见表2。

表2 相对校正因子

2.6 相对校正因子重现性考察

2.6.1 不同仪器和色谱柱对相对校正因子值的影响 考察了2种品牌高效液相色谱仪（Waters e2695、Agilent 1200）和3种不同品牌色谱柱[Agilent Eclipse XDB C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、Kromasil C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）]对相对校正因子的影响，结果见表3，RSD为0.64%，表明在不同液相色谱系统下所得的相对校正因子基本一致。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.6.2 不同柱温、流速、进样体积对相对校正因子值的影响 分别考察了不同柱温（25℃、30℃、35℃）、不同流速（0.9、1.0、1.1 ml/min）、不同进样体积（8、10、12 μl）对相对校正因子的影响，结果表明在不同柱温、流速、进样体积下所得的相对校正因子基本一致。

2.7 QAMS与外标法（external standard method，ESM）结果比较

分别取14批石菖蒲药材粉末（过4号筛），每批3份，按2.2项下平行制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件依次进样测定，记录两种成分的峰面积，分别采用ESM和QAMS计算所测各目标成分含量，结果见表4，可知两种方法计算各成分的含量无明显差异。

表4 QAMS与ESM结果比较（n=3）

3 讨论

3.1 检测波长的考察

本试验对β-细辛醚、α-细辛醚进行全波长扫描，最大吸收波长分别为252、258 nm，参考文献[15-16]并兼顾两种成分的紫外吸收情况，选择254 nm作为检测波长。结果表明在254 nm波长下，基线较为平稳，β-细辛醚、α-细辛醚成分响应值较高，干扰峰较少。

3.2 样品制备方法的选择

分别考察了不同流动相（水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈）、提取溶剂（无水乙醇、甲醇）与提取方式（超声15、30、60 min）对两种待测成分的影响，最终选定以0.05%磷酸水-乙腈溶液为流动相、甲醇超声提取15min为最优方法。

3.3 内参物的选择

石菖蒲挥发性成分中β-细辛醚含量高于α-细辛醚，但由于β-细辛醚对照品极易挥发，且价格昂贵，考虑到α-细辛醚对照品价格较低，化学性质较β-细辛醚更稳定，故本试验选定α-细辛醚作为内参物来计算β-细辛醚的相对校正因子。

4 小结

课题组前期建立了一个可以同时定量β-细辛醚、α-细辛醚的HPLC含测方法。本研究石菖蒲药材种含量较高且性质稳定的α-细辛醚为内标物，建立了α-细辛醚与β-细辛醚的相对校正因子，对石菖蒲药材中的β-细辛醚、α-细辛醚进行含量测定，方法学结果均符合《中华人民共和国药典》要求，在不同品牌仪器、流速、柱温等条件下进样分析发现该方法具有较高的重现性。通过对多批次石菖蒲药材中两成分含量测定，比较QAMS计算的含量值与ESM所测的含量值，结果表明无显著差异。说明建立的α-细辛醚与β-细辛醚之间的校正因子具有较高的可信度。一定程度上解决了石菖蒲挥发性成分含测时β-细辛醚对照品价格昂贵且不易配制的问题，为石菖蒲的质量控制提供了有效的方法。