建立HPLC-RID测定枸杞子中枸杞多糖含量研究

岳玲燕 蒲小彦 何桂英 付明华 邓竹君 涂雨佳

太极集团四川绵阳制药有限公司，四川绵阳 621000

枸杞子来源于茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）干燥成熟果实，具滋补肝肾，益精明目功效[1-2]。始载于《神龙本草经》，是药食同源类中药材[3-4]。宁夏、甘肃、河北均有栽培[5-7]，主含枸杞多糖，另有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆红素、胡萝卜素、核黄素、维生素C等成分[8-9]。现收载于《中华人民共和国药典》2020年版，测定枸杞多糖用苯酚-硫酸法，检测仪器为紫外-可见分光光度计，此法用乙醚、乙醇、水依次回流提取，步骤繁琐，持续4 h，且对照品溶液标准曲线易出现较大误差。故探索一种简便易行、重复性好、准确可靠的方法，测定枸杞子多糖的含量。

1 仪器与试药试剂

1.1 仪器

Agilent1260Ⅱ型色谱工作站和G7162A 1260RID示差折光检测器（美国安捷伦科技有限公司），MSA6.6S-CE型微量电子天平和BSA224S型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，精度分别为0.001、0.1 mg），CRT-1500B型高速粉碎机（永康市超然电器有限公司）。

1.2 试药试剂

D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-202109，纯度99.9%）；乙腈色谱纯（科威化学有限责任公司）；苯酚、硫酸、乙醚（成都科隆化学品有限公司）；药材枸杞子主要从宁夏、甘肃产地收集而得，编号1～6（表1），由主任中药师魏云（绵阳市食品药品检验所）鉴定，符合《中华人民共和国药典》规定。

表1 枸杞子药材信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱填料Prevail Carbohyrate ES（250 mm×4.6 mm，5 μm），编 号LC026；流 动 相 乙 腈-水（70∶30）；柱温40℃；示差折光检测器温度40℃；进样量10 μl，流速1 ml/min。理论板数以无水葡萄糖峰计应不低于3000。

2.2 供试品溶液提取方式及确定

2.2.1 提取方式 取3号枸杞子样品粉碎成粗粉，采取三种提取方式进行样品处理。

方式一：《中华人民共和国药典》枸杞子含量测定苯酚-硫酸法。

方式二：加水超声提取法。取枸杞子粗粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 ml，超声处理（功率250 W、频率50 kHz）30 min，滤过，取续滤液即得。

方式三：加水回流提取法。取枸杞子粗粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 ml，称定重量，回流2 h，放冷再称定重量，用水补足减失重量，摇匀滤过，取续滤液即得。

2.2.2 提取方式的确定 取上述三种溶液按2.1项下测定，记录色谱图并比较，结果表明方式一只出现溶剂峰未检出目标峰；方式二主要成分未充分溶出，使测得值偏小；方式三供试品溶液测得色谱峰最符合系统适用性试验，所得枸杞多糖含量高，效果最佳。故择优选取加水回流提取的方法。见图1～3。

图1 方式一色谱图

图2 方式二色谱图

图3 方式三色谱图

2.3 溶液制备

对照品溶液：精密称取D-无水葡萄糖对照品30.06 mg，置10 ml量瓶中，加水溶解定容至10 ml，摇匀，制成每毫升含3.006 mg的对照品溶液。

供试品溶液：精密称取枸杞子粗粉1.0004 g，置具塞锥形瓶，精密加水50 ml，称定重量，回流2 h，取出放冷，称定重量，用水补足减失重量，摇匀滤过，即得。

阴性样品溶液：按供试品溶液制备项下方法，制成阴性样品溶液。

2.4 方法学考察

系统适用性试验：取2.3项下3种溶液按2.1色谱条件测定，记录色谱图，结果显示对照品溶液与供试品溶液色谱主成分峰保留时间基本一致，分离度＞1.5，表明阴性样品溶液对待测成分无干扰。见图4～6。

图4 对照品溶液色谱图

图5 供试品溶液色谱图

图6 阴性样品溶液色谱图

线性关系考察：精密称取D-无水葡萄糖对照品200.28 mg，置20 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得10.0040 mg/ml对照品贮备液。精密吸取该溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 ml分别置10 ml量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，制得浓度为0.5002、1.0004、1.5006、2.0008、2.5010、3.0012、4.0016 mg/ml对照品溶液，按2.1色谱条件分别进样，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性方程Y=80671X+1326.5，线性范围0.5～4.0 mg/ml，相关系数R2=0.9999，结果表明对照品溶液在浓度范围内与其色谱峰面积线性关系良好。见图7。

图7 色谱峰面积与对照品溶液浓度的线性标准曲线

精密度试验：精密吸取2.3项下对照品溶液按2.1项下条件依次测定6次，记录色谱图和峰面积，计算结果RSD为0.20%，表明仪器的精密度良好。

稳定性试验：取2.3项下供试品溶液，室温放置0、3、6、9、12、15、18 h，按2.1色谱条件测定，记录峰面积，结果RSD为0.50%（n=7），表明供试品溶液室温放置18 h内稳定性较好。

重复性试验：取编号2号枸杞子样品，按2.3项下方法平行制备供试品溶液6份，再按2.1色谱条件分别测定，记录峰面积并计算含量，平均含量278.5 mg/g，RSD为1.60%，表明该方法重复性较好。

加样回收率试验：精密称取已知含量的1号枸杞子9份，含枸杞多糖327.488 mg，精密加入适量D-无水葡萄糖对照品，按2.3项下制得供试品溶液，再按2.1色谱条件进样测定，计算加样回收率，得出D-无水葡萄糖的平均回收率为104.81%，RSD为1.10%。结果见表2。

表2 加样回收试验结果

2.5 样品含量测定

取10批待测枸杞子样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进样测定，记录峰面积计算含量，结果见表3。通过下表数据验证，此方法能有效测定枸杞多糖的含量，控制枸杞子质量，指导该品入库检验。

表3 不同批次枸杞子中枸杞多糖的含量（mg/g）

3 讨论

3.1 枸杞多糖的提取溶剂

枸杞多糖是从枸杞子中提取而得，为白色略带棕色纤维状疏松固体，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖等6种单糖组成[10-11]，含多种微量元素和氨基酸蛋白多糖，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂[12]，是一种水溶性多糖[13]，故以水为提取溶剂，使有效成分更易溶出。

3.2 枸杞多糖的提取时间

试验对回流提取时间进行摸索，设置1、1.5、2、2.5 h，通过比较发现，随提取时间增长，所测得多糖含量也增加，得出2、2.5 h加水回流提取所测得枸杞多糖含量最高且数据接近，所以确定最佳提取时间为2 h。

3.3 仪器设备的色谱条件

通过查阅参考蜂蜜、乳糖、麦芽糖浆[14-15]、蔗糖等品种的含量测定项，对色谱柱、流动相、柱温、示差检测器温度等条件进行以下试验。

试验中选取氨基键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm）和Prevail Carbohyrate ES色谱柱进行对比分析，后者分析出的色谱图理论塔板数、分离度、拖尾因子等均优于前者，故选用Prevail Carbohyrate ES色谱柱。

试验中对流动相乙腈-水（75∶25）和乙腈-水（70∶30）两种进行对比考察，前者出峰时间较快，且色谱峰不能完全分离，于是对此流动相进行优化，结果表明后者流动相检测出的目标色谱峰与杂质峰的分离度＞1.5，故选择乙腈-水（70∶30）为含量测定用流动相。

试验中对柱温和示差检测器温度条件进行了考察，分别设置柱温40℃、35℃、30℃，示差检测器温度40℃、35℃、30℃，结果表明当柱温为40℃、示差检测器温度40℃时色谱峰的分离度最大。

综上所述，通过HPLC-RlD的方法成功摸索出枸杞子中枸杞多糖的提取方式和含量测定方法，具有操作简单快捷、灵敏度高、重复性好、准确可靠、所用试剂种类少、分离效果好等特点，可用于检测药材枸杞子中枸杞多糖的含量，并有效控制枸杞子质量。因该方法采取用水直接回流提取，未进行脱色处理，所以影响色谱柱的性能，降低其使用寿命。