靶向HBV cccDNA形成的部分药物研究进展

梁红妍 申笙 孙剑

作者单位：510515 广州 南方医科大学南方医院感染内科

HBV感染可引起慢性乙型肝炎(CHB)、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌等终末期肝病,严重威胁着人类健康。据WHO报道,全球约有2.96亿慢性HBV感染者[1],而我国约有7500万例,每年因肝硬化、肝衰竭、肝癌等乙型肝炎相关疾病的死亡人数约为30万[2]。现有的一线抗HBV药物主要是核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素(IFN)类药物,可有效抑制HBV复制,但无法彻底清除感染肝细胞核内共价闭合环状DNA(cccDNA),患者难以实现完全治愈[3]。

一、cccDNA的由来

感染肝细胞核内的cccDNA是HBV感染肝细胞后,由松弛环状双链DNA(rcDNA)通过一系列环节修复而成,目前认为大致有以下步骤：(1)去除rcDNA负链5′端共价结合的病毒聚合酶Pol以及5’-flap;(2)去除rcDNA正链 5′端的RNA引物;(3)完成rcDNA正链的修复;(4)连接正负链,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA;(5)cccDNA 与组蛋白、非组蛋白等结合,形成微染色体样结构[4]。cccDNA作为HBV复制的原始模板,长期稳定存在于被感染细胞的核内,是HBV感染慢性化的主要因素之一。

二、cccDNA的检测方法

目前能够直接检测cccDNA的方法中,qPCR缺乏标准化的cccDNA定量方法,Southern blot方法复杂且相对不敏感。更重要的是,在感染细胞中,cccDNA的丰度较低,拷贝数量少[5],准确测量cccDNA水平并区分对其丰度的直接和间接影响在技术上具有挑战。因此,缺乏可靠、可重复和足够敏感的检测方法,导致无法直接筛选影响核内cccDNA形成的相关因素[6]。

三、cccDNA的体外研究

Qi等[7]通过Cre/loxP位点特异性重组从而诱导HBV重组cccDNA(rcccDNA)产生的策略,首次建立了HBV rcccDNA体外培养细胞模型。rcccDNA能够在肝细胞核中被大量诱导产生,因此能够作为一种有用的替代分子进行HBV cccDNA相关研究[8]。而Li 等[9]则将Gaussia 荧光素酶报告基因插入到 HBcAg 编码框中,通过应用体外微环 DNA 重组和纯化技术获得 rcccDNAattR,并证实其能够在转染 Huh7 细胞中产生子代病毒。此外,Yan等[10]利用微环DNA技术,体外制备了重组HBV共价闭合环状DNA,称为HBVcircle系统,可以在细胞和小鼠体内持续存在,并表达HBV相关抗原和基因组DNA。同时,对该系统进行评估发现,临床上常见的抗HBV药物可以有效抑制病毒在小鼠体内的复制,为研发新的抗HBV药物提供了平台。

为实现乙型肝炎的临床治愈甚至完全治愈,cccDNA的清除是科学家们致力攻克的难题。其中,直接靶向cccDNA显然是一个非常具有吸引力的治疗策略。近年来,在上述研究平台的助力下,直接靶向HBV cccDNA形成的宿主因子和小分子化合物等研究取得了一定的进展,为抗HBV药物的研发提供了新的方向。

四、靶向cccDNA形成的宿主相关因子

Wei等[11]利用酵母细胞系统,发现宿主细胞的五种修复因子：增殖细胞核抗原(PCNA)、复制因子C(RFC)复合物、DNA聚合酶δ(POLδ)、瓣状结构特异性内切酶1(FEN-1)和DNA连接酶1(LIG1),可在体外将HBV rcDNA修复为cccDNA,并进一步发现rcDNA正、负链的修复是相互独立的,其中正链的修复需要这五种修复因子的参与,而负链的修复只需要FEN-1和LIG1[12]。而Marchetti等[13]通过蛋白质组学技术,鉴定与rcDNA结合的蛋白质,发现DNA损伤结合蛋白2 (DDB2)可与rcDNA结合,进一步验证发现,DDB2沉默可以降低HBV RNA、HBcAg和HBeAg水平,并影响cccDNA形成。因此,靶向参与cccDNA形成过程的宿主修复因子,有望成为减少cccDNA的可行策略。

Kinoshita等[14]通过siRNA筛选确定了前mRNA加工因子31 ( PRPF31)与cccDNA的形成相关。在Hep-AD38细胞中,siRNA敲低PRPF31可减少cccDNA的形成,但不影响HBcAg和HBV core DNA水平。而Wang等[15]通过筛选具有抗病毒活性的宿主蛋白,发现干扰素刺激基因MX2的抑制活性最高。其中,MX2可以通过抑制HBV RNA转录以及病毒复制发挥抗HBV效应,同时也可以通过抑制rcDNA转化成cccDNA来降低肝细胞内cccDNA水平。

此外,Verrier等[16]建立了一种基于细胞的HBV cccDNA报告基因检测方法,通过ELISA检测分泌的HA标记DHBeAg作为cccDNA形成的有效替代标志物,实现对cccDNA的非侵入性监测,并鉴定了27个候选cccDNA宿主因子。其中,YBX1在cccDNA形成中的作用在HBV感染模型中被验证,表现为YBX1沉默后,cccDNA水平显著下降,证实了它在HBV生命周期的早期阶段(病毒进入后但在被感染肝细胞中初始cccDNA库建立之前)的作用。有趣的是,若病毒已感染HepG2-NTCP细胞导致初始cccDNA池已经建立,此时敲低YBX1,并不会减少HBV感染水平。

以上研究提示,靶向cccDNA形成的宿主因子可能有效减少肝内cccDNA。目前发表的研究表明,已有多种小分子抑制剂能够靶向部分参与cccDNA形成过程的宿主修复因子,包括：aphidicolin(DNA聚合酶α和δ抑制剂)、FEN-1核酸内切酶抑制剂PTPD、拓扑异构酶抑制剂、DNA连接酶抑制剂以及DNA检查点激酶ATR和CHK1抑制剂[17]。这些抑制剂在体外细胞模型中表现出较好的抑制cccDNA合成的能力,但这些抑制剂的成药性仍有待进一步研究。

五、靶向 cccDNA 的小分子化合物

2012 年, Cai等通过将HBeAg作为cccDNA的替代性标志物,高通量筛选了一个含85 000种化合物的in-house化合物库, 最终发现两种磺酰胺类化合物(CCC-0975和CCC-0346)可显著降低细胞中cccDNA的水平。机制研究表明, 这两种化合物通过抑制rcDNA去蛋白化, 进而抑制rcDNA形成cccDNA, 最终降低细胞中cccDNA的水平[18]。这是首次发现小分子能靶向cccDNA生成,但这种磺酰胺类似物的确切机制尚未被阐明。

2016年, Liu等[19]通过筛选中草药化合物库, 发现3种化合物(punicalagin、punicalin以及geraniin)以剂量依赖的方式显著减少HBeAg和cccDNA的产生。机制研究表明,这些化合物通过抑制cccDNA的形成,并促进cccDNA的衰变,从而下调HBV cccDNA水平。

2022 年,Chen等通过高通量筛选发现氧杂蒽酮类是一种新型HBV cccDNA抑制剂, 随后通过结构优化鉴定出具有高抗病毒活性和药代动力学特征的先导化合物。其中,代表性化合物59在HBVcircle小鼠模型中,可显著下调血清中HBsAg、HBeAg以及肝内cccDNA的水平[20]。此外,Wang等[21]通过在HBV感染的人原代肝细胞和HepDES19细胞中高通量筛选发现一种可降低cccDNA水平的小分子化合物ccc_R08,并在HBVcircle小鼠模型及人肝嵌合小鼠模型中得到验证。该研究显示ccc_R08可降低小鼠血清中的HBsAg、HBeAg、HBV DNA、pgRNA及肝细胞中的cccDNA水平,这是首次发现有小分子可作用于已建立的cccDNA库,为彻底清除cccDNA提供了一种新的途径。

与靶向cccDNA形成的宿主因子相比,直接靶向cccDNA可能更具有特异性,但这两类小分子化合物目前仍处于临床前研究阶段,尚未有研究横向比较它们的有效性。同时,直接靶向cccDNA相较于靶向cccDNA形成的宿主因子是否更具安全性,仍需要更多的研究论证。

综上,cccDNA是HBV复制的原始模板,长期稳定存在于被感染细胞的核内,是导致HBV感染慢性化的主要因素之一。科学家们一直在致力于研发清除cccDNA的策略,并在直接靶向HBV cccDNA形成的宿主因子和小分子化合物等方面取得了一定的研究进展,为抗HBV药物的研发提供了新的方向,为实现乙型肝炎治愈指明了道路,为cccDNA的清除和乙型肝炎的完全治愈带来希望。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。