红瑞木果多糖抗氧化活性的初步研究 *

高长久 李文超 张朝立 孟令锴 王春辉

（牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011）

红瑞木果（Swida albaOpiz）始载于《中华本草》，为山茱萸科山茱萸属（梾木属）植物红瑞木［红瑞山茱萸（Cornus albaL.）］的果实。红瑞木的树皮、枝叶和果实均可入药，其果实入药具有滋肾强壮等功效，主治肾虚腰痛、体弱羸瘦等病证［1］。现代研究发现，其化学成分主要有黄酮类、多糖、苷类、酚酸、花青素、氨基酸等［2-5］，具有抑菌、抑酶、抗癌等药理作用［6，7］。本研究采用羟基自由基（·OH）清除实验、二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）清除实验和三价铁离子（Fe3+）还原实验对红瑞木果多糖的抗氧化活性进行评价，为其后续研究及开发应用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂红瑞木果多糖采用超声辅助提取法从红瑞木果中水提而得。正丁醇（浙江天诺化学有限公司，批号20211220）；三氯甲烷（南京化学试剂股份有限公司，批号20221015）；DPPH·（上海麦克林生化科技有限公司，批号20230228）；双氧水（H2O2）（山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号20230517A）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）（上海尚宝生物科技有限公司，批号20230608）；三氯化铁（无锡市亚泰联合化工有限公司，批号20220930）；抗坏血酸（Vc）（批号20220526）、硫酸亚铁（FeSO4）（批号20211020）、水杨酸（批号20220618）、无水乙醇（批号20230112）、铁氰化钾（批号20230409）、三氯乙酸（批号20221201），均由福晨（天津）化学试剂有限公司提供。

1.2 实验仪器电子天平（厦门莱斯德科学仪器有限公司，型号QL620）；紫外可见分光光度计（山东霍尔德电子科技有限公司，型号HD-UV90）；多用途恒温超声波提取机（江苏天翎仪器有限公司，型号TL-650CT）；高速离心机（青岛精诚仪器仪表有限公司，型号JC-12L）；恒温水浴锅（上海互佳仪器设备有限公司，型号HHWO2L）；漩涡混匀器（上海靳澜仪器制造有限公司，型号JL-S）。

1.3 实验方法

1.3.1 红瑞木果多糖预处理以功率400 W、时间6 min、温度50 ℃、液料比25∶1 g/mL 的最佳条件对红瑞木果进行水提，然后合并糖液并旋蒸浓缩。向糖液中加入Sevage试剂（正丁醇∶三氯甲烷=1∶3）并剧烈搅拌，再置于分液漏斗中静置12 h，将底层蛋白液倒掉，直至不再出现蛋白层。将除蛋白后的多糖溶液浓缩到200 mL，装入透析袋中透析。透析后的多糖溶液置于5000 mL 的大烧杯中，加满无水乙醇，醇沉12 h 后离心（转速：4000 r/min，时长：5 min，离心半径：15 cm），留沉淀，晾干即得红瑞木果多糖。取适量红瑞木果多糖用蒸馏水配制浓度范围为0.25～1.50 mg/mL 的多糖样液，浓度梯度为0.25 mg/mL，即得0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL的红瑞木果多糖样液。

1.3.2 红瑞木果多糖对DPPH·清除能力的测定参照邓永蓉等［8］的方法，并作部分改动。取6 支试管，向各试管中分别加入2 mL 已配制好的6 个浓度梯度红瑞木果多糖样液，再向各试管分别加入2 mL 的DPPH·溶液（0.1 mmol/L），充分振荡混匀，25 ℃避光水浴30 min，紫外517 nm 分别测定各支试管内混合溶液的吸光度值，即得样本吸光度值（A1）；其余操作不变，仅把多糖样液替换为2 mL 的蒸馏水，即得阴性对照吸光度值（A0）；仅把DPPH·溶液替换为2 mL 的蒸馏水，即得样本吸光度值（A2）。平行测定3次，选择Vc作为阳性对照。

多糖对DPPH·清除率计算公式：DPPH·清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%。

公式中：A0为DPPH·+蒸馏水的吸光度，A1为多糖样液+DPPH·的吸光度，A2为多糖样液+蒸馏水的吸光度。

1.3.3 红瑞木果多糖对·OH 清除能力的测定参照刘宇等［9］的方法，并作部分改动。取6支试管，向各试管中分别加入1 mL 的H2O2溶液（9 mmol/L）、1 mL 的FeSO4溶液（9 mmol/L）、1 mL 的蒸馏水和1 mL 的水杨酸无水乙醇溶液（9 mmoL），再向各试管中分别加入1 mL 已配制好的6个浓度梯度红瑞木果多糖样液；充分振荡混合，37 ℃水浴35 min，紫外510 nm 下检测样本吸光度值（A1）；其余操作不变，仅把多糖样液替换为1 mL 的蒸馏水，即得阴性对照吸光度值（A0）；仅把水杨酸溶液替换为1 mL 的蒸馏水，即得样本吸光度值（A2）。平行测定3次，选择Vc作为阳性对照。

多糖对·OH 清除率公式：·OH 清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%。

公式中：A0为水杨酸+蒸馏水的吸光度，A1为多糖样液+水杨酸的吸光度，A2为多糖样液+蒸馏水的吸光度。

1.3.4 红瑞木果多糖对Fe3+还原力的测定参照薛小兰等［10］的方法，并作部分改动。取6支试管，向各试管中分别加入1 mL 已配制好的6 个浓度梯度红瑞木果多糖样液，再向各试管中分别加入1 mL的PBS溶液（0.2 mol/L，pH 值=6.6）和1 mL 的铁氰化钾溶液（1%），50 ℃水浴25 min 后用冰块快速冷却，再分别向各试管中加入1 mL的三氯乙酸溶液（10%），充分振荡混合，离心（转速：3600 r/min，时长：10 min，离心半径：15 cm），取上清液0.1 mL 置于另外的干净长试管中，再向每个试管中加入3 mL 的蒸馏水和1 mL 的三氯化铁溶液（0.1%），混合均匀，紫外700 nm 下检测样本吸光度值（A1）；其余操作不变，仅把多糖样液替换为1 mL的蒸馏水，即得阴性对照吸光度值（A0）。平行测定3 次，选择Vc 作为阳性对照。

多糖对Fe3+还原力公式：Fe3+还原力=A1-A0。

公式中：A0为三氯化铁+蒸馏水的吸光度，A1为多糖样液+三氯化铁的吸光度。

2 结果

2.1 红瑞木果多糖对DPPH·的清除率在0.25～1.50 mg/mL 浓度范围内的红瑞木果多糖溶液和Vc 溶液对DPPH·的清除率见图1。红瑞木果多糖和Vc 对DPPH·均有较好的清除能力，其清除率随着浓度的增加而提高。当红瑞木果多糖溶液和Vc 溶液浓度达到1.5 mg/mL 时，二者清除率达到该浓度范围内的最大值，分别为79.3%和97.5%。

图1 红瑞木果多糖和Vc对DPPH·的清除率

2.2 红瑞木果多糖对·OH的清除率在0.25～1.50 mg/mL浓度范围内的红瑞木果多糖溶液和Vc溶液对·OH的清除率见图2。红瑞木果多糖和Vc 对·OH 均有较好的清除能力，其清除率随着浓度的增加而提高。当红瑞木果多糖溶液和Vc 溶液浓度达到1.5 mg/mL 时，二者清除率达到该浓度范围内的最大值，分别为60.6%和94.8%。

图2 红瑞木果多糖和Vc对·OH的清除率

2.3 红瑞木果多糖对Fe3+的还原力在0.25～1.50 mg/mL浓度范围内的红瑞木果多糖溶液和Vc 溶液对Fe3+的还原力见图3。红瑞木果多糖和Vc 对Fe3+均有较好的还原能力，其还原力随着浓度的增加而提高。当红瑞木果多糖和Vc浓度达到1.50 mg/mL时，二者还原力达到该浓度范围内的最大值，分别为0.565和0.856。

图3 红瑞木果多糖和Vc对Fe3+的还原力

3 讨论

多糖（Polysaccharide）又称多聚糖，在自然界广泛分布于植物、动物和微生物中，是自然界含量最丰富的生物聚合物。天然多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖，是构成细胞壁或细胞膜的四大基本物质之一，是一类具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗炎、抗疲劳和抗衰老等生物活性的生物大分子［11］。本研究主要采用·OH 和DPPH·清除实验及Fe3+还原实验对红瑞木果多糖的抗氧化活性进行评价［12］。

初步研究发现，红瑞木果多糖对DPPH·、·OH 具有不同程度的清除作用，对Fe3+具有还原作用，且存在明显的量效关系。当红瑞木果多糖浓度达到1.50 mg/mL时，对两种自由基的清除率分别为79.3%、60.6%，对Fe3+的还原力为0.565。表明红瑞木果多糖具有一定的抗氧化活性，将来可能开发为一种有效的天然抗氧化剂。但由于本研究中红瑞木果多糖为粗提物，对结果可能会有影响。所以，在本研究初步确定红瑞木果多糖抗氧化活性的基础上，今后将对粗多糖进行分离和纯化，筛选出具有抗氧化活性的部位或单体，为今后红瑞木果多糖的应用提供依据。