先天性颅锁骨发育不全家系基因诊断探讨

高 超 宋丽佳

郑州市儿童医院康复中心一区 郑州 450053

锁骨颅骨发育不全(Cleidocranial dysplasia,CCD)是一种少见的全身性骨发育障碍及骨—牙形成障碍性疾病,呈常染色体显性遗传,该病病理上主要表现为膜内成骨障碍,同时也可存在软骨发育障碍,临床上表现为囟门不闭合或闭合延迟、锁骨成骨不良、牙齿发育不全和侏儒等,病变可累及人体所有的膜内化骨和软骨内化骨的骨骼。本研究应用基因检测的方法对两个中国人CCD不全家系进行基因诊断,现报告如下。

1 对象和方法

1.1 对象 受试者来自经过详细的遗传病学调查、临床和放射学检查得到明确诊断的两个CCD家系[1]。家系1中有2名男性受累,先证者1岁6个月,父亲27岁,2例患者身材均较同龄人矮小,头面部比例失调,头大面小,眼距增宽,鼻梁塌陷,双肩在胸前不同程度地靠拢。父亲前囟未闭,身高150 cm,儿子前后囟均增大,前囟4 cm×4 cm,颅缝增宽以矢状缝明显,未出牙,喉软骨发育不全,锁骨短小,双肩下垂,肩关节活动度增大,胸部呈鸡胸。家系2中3名女性和2名男性受累,先证者1岁,前囟未闭,未出牙,锁骨短小,双肩下垂,肩关节活动度大;其母亲25岁,前囟近闭,身材矮小,眼距增宽,鼻梁塌陷,出现多个多生牙。两个家系中的4位健康成员和50位无关健康人作为对照。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取:经受试者知情同意,共收集两个家系4例患者、4位健康成员及50位健康体检人员外周血,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用小量外周血白细胞基因组DNA快速抽提纯化试剂盒(大连宝生物有限公司),取全血1 mL提取基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增:合成7对寡核苷酸引物,对CCD致病基因RUNX2的7个编码外显子及其相邻的内含子序列进行PCR扩增[2]。50μ L反应体系:上下游引物各2 μ L(浓度5 pmol/L),2×Taq PCR MasterMix 25 μ L(0.1U Taq Polymerase/μ l,500μ M dNTP,20 mM Tris-HCL,100 mM 氯化钾,3 Mm氯化镁;北京天根生化科技有限公司),模板DNA适量(约100 ng),灭菌超纯水补足体积。由于外显子1的扩增序列中GC含量高,其PCR反应体系中又加了终浓度为6%的二甲基亚砜(DMSO)。反应条件94℃5 min;94℃30 s,55～65℃梯度退火60 s,72℃30 s,循环32次;72℃5 min。

1.2.3 PCR产物纯化及测序:PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下切取目的DNA条带,纯化回收,纯化后的PCR产物进行双向直接测序。

2 结果

将RUNX2的7个编码外显子的测序结果与正常序列进行比较,发现家系1中父子两个患者外显子1的346处正反向测序均显示T/A杂合双峰,而该家系健康者和正常对照测序中未见这种改变,表明患者发生了c.346T→A的杂合突变。该突变导致 RUNX2第116位氨基酸的密码子TGG被AGG取代,从而使其编码的色氨酸变成精氨酸,即W116R。家系2两个受试患者外显子3正反向测序都在610处显示A/T杂合双峰,即患者出现了c.610A→T的杂合突变,该家系健康成员和正常对照测序结果未见这种改变。此突变导致RUNX2编码的转录因子第204位氨基酸的密码子AAA被UAA取代,从而使其编码的赖氨酸变成终止密码(K204X),致使其后的多肽链翻译终止。也就是说c.346T→A和c.610A→T的杂合突变是引起两个家系患者发病的分子基础。

3 讨论

传统的疾病诊断方法都是以疾病表型改变为依据,但表型改变很多并不是特异的,出现时间也较晚,往往不能及时、及早地明确诊断,失去早期预防和治疗的机会。基因诊断不仅可以帮助确诊现患者,估计预后,更重要的是能诊断症状前患者,给他们的生活方式提出合理建议,检出女性携带者,为她们提供遗传咨询,预测再发风险和提供产前诊断。

CCD的致病基因(CBFA1)编码成骨细胞特异性转录因子,是哺乳动物编码转录因子PEBP2/CBF异二聚体α亚单位的三个基因之一[3]。研究发现RUNX2基因敲除小鼠模型没有骨组织和成骨细胞,这表明该转录因子为成骨细胞分化所必需,在维持正常的骨骼生长发育中起着重要的作用。迄今报道引起CDD患者受累的RUNX2基因突变包括缺失、插入、错义突变、无义突变及剪接体突变等多种类型,但以发生在“Runt域”的错义突变最常见[4]。在已报道的导致中国人散发和家族性CCD发病的基因突变几乎都是“Runt域”的点突变所致错义突变[5]。本研究鉴定出的引起两个中国人家族性CCD的致病突变也均为“Runt域”的点突变,说明“Runt域”的点突变是中国人RUNX2突变的主要类型,但其中一个为无义突变。

典型CCD一般临床即可诊断,但对于轻症特别是仅有牙齿萌出异常的患者临床诊断困难,检测RUNX2基因可以进行基因诊断;由于本病目前尚无确切有效的治疗手段且外显率高,对于已发现的CCD患者应进行遗传咨询,通过产前诊断发现携带致病基因的胎儿,可以及时终止妊娠。虽然以往报道的RUNX2突变中有几个热点突变,但随着对更多CCD家系的基因检测,发现了越来越多的新突变类型,例如本研究两个中国人群无关家系的致病突变均为新突变,因此,对RUNX2基因的所有7个外显子及其侧翼进行测序是比较准确有效的基因诊断方法。

[1] 高超,吴丽,耿香菊,等.先天性颅锁骨发育不全家系分析[J].中国实用神经疾病杂志,2010,13(23):54-55.

[2] 高超,吴丽,耿香菊,等.两个新RUNX2基因突变引起家族性锁骨颅骨发育不全[J].中华医学遗传学杂志,2010,27(2): 140-143.

[3] Ogawa E,Maruyama M,Kag oshima H,et al.PEBP2/PEA2 represents a family of transcription factors homologous to the products of the Drosophila runt gene and the human AM L1 gene[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:6 859-6 863.

[4] Kim HJ,Nam SH,Kim HJ,et al.Four novel RUNX2 mutations including a splice donor site result in the cleidocranial dysplasia phenotype[J].J Cell Phy siol,2006,207,114-122.

[5] Xuan D,Li S,Zhang X,et al.Mutations in the RUNX2 gene in Chinese patients with cleidocranial dysplasia[J].Ann Clin Lab Sci,2008,38:15-24.