乳酸菌在饲料青贮中的应用及研究进展

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(1.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙包头 014109；2.内蒙古农业大学)

乳酸菌是促使青饲料发酵的主要微生物，是指一类以糖为原料的消耗葡萄糖50%以上、厌氧型、产生乳酸、革兰氏阳性，不形成芽孢的细菌。乳酸菌依其发酵糖生产乳酸的能力分为两类，一类是同型发酵乳酸菌(Homo-fermentative lactic acid bacteria);另一类是异型发酵乳酸菌(Hetero-fermentative lactic acid bacteria)[1]。同型发酵乳酸菌在生产乳酸和青贮饲料方面更有效,耗能更少，且容易保存营养物质，属比较经济的发酵类型。

青贮能否成功则很大程度上取决于同型发酵乳酸菌能否迅速大量繁殖，筛选并培养最适合的乳酸菌是关键，调节青贮料内微生物区系，调控青贮发酵过程，创造适宜的厌氧环境，促进多糖物与粗纤维的转化，从而有效地提高青贮饲料的质量，这是近30年来青贮研究的热点。

本文主要对乳酸菌在饲料青贮中的应用及研究进展进行简要综述，供参考。

1 乳酸菌(LAB)在饲料青贮中的应用

1.1青贮历史 青贮饲料在世界各地有着悠久的发展历史。据考证，青贮饲料起源于古埃及文化鼎盛时期(McDonald，1981.)[2]；在我国，600多年前的元代(王祯农书)和清代(风广义)中曾记载有苜蓿、马齿苋等青饲料的发酵方法。但实际应用于生产是在18世纪初期，1885年德国人库英(G.Kuin)及G.Frg报道了青贮饲料技术方面的文章；我国最早关于青贮饲料的试验研究报道是1944年发表于《西北农林》的“玉米窖贮藏青贮料调制试验”。1943年西北农学院教授王栋、助教卢得仁首次进行带棒玉米窖贮藏青饲料，并向陕西及全国推广。

1.2微生物青贮剂的种类和研究概况 微生物青贮剂(SIB)，又称青贮接种菌，生物青贮剂，青贮饲料发酵剂，是专门用于饲料青贮的一类微生物添加剂，由一种或多种乳酸菌、酶和一些营养物组成，采用人工加入菌种的方法，有利于这类乳酸菌尽快达到足够的数量，加快乳酸菌发酵产酸，决定着青贮质量的好坏。

1.2.1乳酸菌制剂 理想的青贮应是乳酸菌控制整个发酵过程，乳酸生成占绝对优势。乳酸菌制剂的添加或直接接种乳酸菌可以加快乳酸菌发酵进程，改善青贮发酵品质，如Seale等(1986)[3]研究报道其添加效果明显。Weinderg.等(1996)[4]研究指出，采食添加乳酸菌制剂青贮料的家畜，产奶量和日增重显著提高。Fllya等(2007)[5]研究表明，乳酸菌接种剂对苜蓿青贮具有极好的效果，可以降低pH值，改善发酵品质。上述结果表明，接种乳酸菌或添加乳酸菌制剂可明显改善饲料的发酵品质，提高动物生产性能。目前主要使用的菌种有Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium和Pediococcus pentosaceus等。

据Naoki Nishino(1999)[6]等报道，近年来，Ohshima等进行的绿色发酵汁(PFJ)调制青贮研究。PFJ类似于乳酸菌制剂，通过发酵培养植株上的固有乳酸菌以达到乳酸菌迅速增殖的目的。添加PFJ可明显降低生产成本，工艺流程简单，且添加入青贮料后可迅速提高青贮料中的乳酸含量，降低pH值，抑制梭菌活动，保护蛋白质的分解损失，在改善青贮发酵品质方面较乳酸菌更稳定。据韩瑞丽(2002)[7]报道，PFJ可以使附着在牧草表面的乳酸菌群增殖，作为乳酸发酵的启动因子，显示其有效性，是乳酸菌制剂的一种良好替代品。

1.2.2碳水化合物类 碳水化合物类添加剂能直接弥补乳酸菌发酵底物较低的缺陷，如糖蜜，是制糖工业的副产物，添加入青贮料后，可使pH及NH3-N含量降低，乳酸及可溶性糖的含量增加，同样添加适量葡萄糖可明显提高苜蓿青贮品质。

1.2.3细胞壁降解酶 主要作用于两方面，一是降解细胞壁成分，增加青贮发酵底物，促进乳酸发酵优势的形成;二是酶降解作用后易被瘤胃微生物作用，提高有机物消化率。据YuZhu, Naoki Nishino等(1999)[8]报道，添加细胞壁降解酶的苜蓿青贮与对照组相比，乳酸含量明显提高(P<0.01)，pH值下降(P< 0.01)，且对经处理后的青贮料进行瘤胃降解试验，发现可快速降解DM，从而使青贮料品质得到明显改善。

1.2.4纤维素酶 据席兴军等(2003)[9]报道，在玉米秸青贮饲料中加入乳酸菌和纤维素酶，可使青贮料中的氨态氮与总氮比、NDF、ADF含量显著降低，青贮品质得到明显的改善。

2 乳酸菌的研究进展

乳酸菌是微生物青贮剂中最早应用的菌种，研究报道最多。近年来，许多学者对乳酸菌性质，特别是分子生物学方面进行了研究，取得了较多的新进展。

黄良昌等(2002)[10]曾对保加利亚乳酸菌的浓缩培养进行了研究。优化培养条件:发酵时间为12 h，起始pH值5.80，发酵温度40℃；确定MRS为培养基:MRS+7.5%番茄汁+12%麦芽汁+0.009 mol/L CaCl2+2%乳清。通过中和试验，可使菌体浓度达到9.55×109个/mL。

李霞等(2005)[11]应用改良MRS培养基，对保加利亚乳酸菌进行了超浓缩培养，培养过程中，采用了离心式半连续培养技术，最终使菌体浓度达到了1.045×1010个/mL。

近年来，黄红等(2004)[12]对乳酸菌素进行了详细研究。日前国内外报道的乳酸菌素约有40余种，乳酸菌素是在乳酸菌代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽。分别由乳球菌、片球菌、明串球菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌、肉食杆菌等属的菌株产生。乳酸菌可通过其代谢产物，主要是酸性物质和乳酸菌素等，起到有效的抑菌作用。

乳酸菌素的功能类似抗菌素，但作用机制不同，具专一性，完全不产生抗药性及毒性，可有效抑制病原菌的生长。乳酸菌素的代谢产物(Nisin乳链菌肽)，能有效抑制多种导致腐败的革兰氏阳性菌，尤其对产生芽孢的细菌特别有效，是一种高效、无毒的天然抑菌剂。抑菌实验表明，乳酸菌素不仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，而且对革兰氏阴性菌也有不同程度的抑制作用，故可治疗胃、肠炎。乳酸菌素还能促进胃液分泌，增强胃肠蠕动，促进食物消化。目前的药用制剂有丽珠肠乐、普乐拜尔等。

据Alexander等(2001)[13]报道，自2001年完成第一株乳酸菌即乳酸乳球菌IL 1403的全基因组测序以来，目前已公布完成测序的乳酸菌包括:乳酸乳球菌IL1403、长双歧杆菌NCC2705、植物乳杆菌WCSF1、约氏乳杆菌NCC533及嗜酸乳杆菌NCFM/ATCC700396等。乳酸菌基因组的大小在一个特定的范围内，从1.8～2.6 Mb不等，只有植物乳杆菌相对较大，为3.3 Mb。乳酸杆菌和双歧杆菌分别具有较低和较高的GC含量，乳酸杆菌的GC含量为30.9%～50%不等，而长双歧杆菌则高达60.1%。另外，还有一些乳酸菌具有非常复杂的插入重复序列(IS)，说明该菌具有较高的遗传可塑性。

据王保平等(2010)[14]报道，乳酸菌遗传学研究开始于20世纪70年代初，由于乳酸菌在青贮饲料中有着十分重要的作用，从而激发了人们对染色体外遗传物质，即质粒的研究。质粒(plasmid)是一段存在于染色体外或整合在染色体上的共价闭合环状双链DNA分子，含50～100个基因。质粒可独立存在于细菌染色体外，能够进行自我复制、稳定遗传和表达;也可整合和消失，并可在一定范围内进行细胞间传递。许多次生代谢产物(如抗生素、色素)的合成一般受质粒控制。质粒并非细菌生命活动所必需，但可携带决定细菌某些遗传特性的基因，是遗传工程的重要载体。

目前，已有多种方法可从细菌中提取质粒DNA，如碱裂解法、煮沸法、微波炉法，此外还有有机溶剂法等。2008年，刘红娟等结合Anderson与Sullivan等的乳酸菌质粒提取方法和质粒提取原理设计了乳酸菌质粒提取方法，并对其中的各个步骤进行了优化，确定溶菌酶用量为2.5 mg/mL，作用时间为15 min，加入异丙醇后室温放置5 min,从而得到了一种乳酸菌质粒DNA高效、快速的提取方法。

乳酸菌质粒的研究是乳酸菌遗传学研究的基础，乳酸菌质粒的研究对于筛选新的优良菌种，改良现有的生产菌种具有良好的作用。如果把异型发酵菌种中可以调高有氧稳定性的基因，通过基因重组，建立良好的基因工程，再加入同型发酵菌中进行改良，则可为饲料工业带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。

3 小结与展望

乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，因其在各个领域中的长期应用已证明不具有致病性，被公认为安全级(GRAS)微生物。20世纪90年代，国内外学者开始致力于对乳酸菌分子生物学及作用机制的研究，以乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌作为基因工程受体菌，应用基因工程技术有目的、有选择地研制新一代微生态制剂，通过分子生物学技术的不断进步为人们探索其新的应用潜力提供了基础。

Le LOIR和RAW N等相继开发出多种适合于乳酸球菌的信号肽系列(Langella，2001)[15]，为探索其他外源蛋白在乳酸菌中的大量表达奠定了基础。乳酸杆菌是一种良好的疫苗载体，用乳酸杆菌作为疫苗载体不仅可使口服的乳酸杆菌刺激产生粘膜及全身免疫反应，提高某些免疫活性因子，如IL-2,IFN-α的分泌，而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道，同时也可穿过肠壁进入粘膜下层，进而引起细胞免疫和体液免疫。更有意义的是，法国和巴西已于2000年联手开展在乳酸杆菌中表达轮状病毒的抗原基因，然后用重组的乳酸杆菌发酵生产酸奶，来预防轮状病毒性腹泻。总之，随着基因工程技术的发展及研究水平的不断提高，通过对乳酸菌进一步改造、表达调控的认识不断深入和对免疫学特别是粘膜免疫机制的研究，可以肯定将会得到更为优良的益生乳酸菌基因工程菌。

随着人们对乳酸菌功能了解的深入，乳酸菌的生物青贮剂的需求量也将进一步增大。因此，对应用于饲料青贮中的乳酸菌种进行进一步研究和开发有着重要意义。

总之，未来乳酸菌的应用范围将更加广泛，功能将更加完备，乳酸菌的研发和应用将具有更广阔的发展前景。

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