少腹逐瘀汤中7种有效成分的HPLC-PDA分析与评价

崔文霞， 束 艳， 宿树兰*， 邬 璟， 段金廒*， 唐于平

(1.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013;2.南京中医药大学 江苏省方剂研究重点实验室，江苏 南京 210046)

少腹逐瘀汤(Shaofu Zhuyu Decoction，SFZYD)源于清代王清任的《医林改错》，由当归、赤芍、川芎、五灵脂、蒲黄、小茴香、干姜、肉桂、延胡索、没药十味中药组成。方中以当归、赤芍、川芎为君药，具有活血化瘀、养血调经之功效;五灵脂、蒲黄、延胡索、没药为辅药，以通利血脉、祛瘀止痛;小茴香、干姜、肉桂为佐药，温经散寒、理气止痛，并引诸药直达少腹，全方组合具有温经散寒、活血化瘀、消肿止痛之功效［1］。现代研究表明，少腹逐瘀汤具有解痉、镇痛、抗炎、改善血液循环的药理作用［1-3］，但少腹逐瘀汤效应物质研究相对较少。

本课题组在前期研究工作中采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)分析鉴定了其中11个主要的化学成分［1］;采用高效液相色谱法(HPLC)分析评价了其有效部位中的7个化学成分［4］。本实验在效应物质基础研究的基础上［5-8］，采用HPLC法对其中多种效应成分，包括咖啡酸、阿魏酸、没食子酸、香草酸、芍药苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷进行定量分析，并考察了少腹逐瘀汤水煎液和醇沉上清液中主要活性成分的含量差异，比较不同前处理方法对有效成分测定的影响，最终建立简便可行的同时测定少腹逐瘀汤中多种类型有效成分的HPLC分析方法，为少腹逐瘀汤的复杂效应物质及其作用机理的揭示提供了一定参考。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996 PDA检测器，Empower工作站;Startorius电子天平，型号:BT1250;KQ-250E型超声波清洗器(工作频率40 KHz);Anke(TDL240B)离心机(上海安寿科学仪器厂);EPED超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司)。

对照品没食子酸(批号:110831-200302)，香草酸(批号:110776-200402)，咖啡酸(批号:110885-200102)，阿魏酸(批号:110773-200611)，芍药苷(批号:110736-200934)，异鼠李素-3-O-新橙皮苷(批号:111571-200402)，香蒲新苷(批号:111573-200503)上述对照品购于中国药品生物制品检定所。化学结构式见图1。

图1 各对照品化学结构式Fig.1 Chemical structures of reference substances

甲醇(江苏汉邦科技有限公司)及乙腈(美国TEDIA公司)均为色谱纯，乙酸(国药集团化学试剂有限公司)为分析纯，超纯水为实验室自制。

组方药材均购于南京市药业股份有限公司，经南京中医药大学段金廒教授鉴定，均符合《中华人民共和国药典》(2010年版)项下标准。

2 色谱条件

色谱柱:Dikma Diamonsil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相 乙腈(A)-0.05%乙酸溶液(B)，梯度洗脱(0～8 min:A 0% ～5%;8～10 min:A 5%;10～30 min:A 10%～16%;30～45 min:A16%～24%;45～86 min:A 24% ～44%);体积流量:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量10 μL。没食子酸，香草酸测定波长为270 nm;咖啡酸，阿魏酸测定波长为320 nm;芍药苷测定波长为230 nm;香蒲新苷，异鼠李素-3-O-新橙皮苷测定波长350 nm。在上述色谱条件下，对照品色谱图和样品色谱图见图2～6。

图2 7种混合对照品溶液的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 7 reference substances

图3 50%甲醇处理少腹逐瘀汤的HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of SFZYD dealt with 50%methanol

3 溶液制备

3.1 供试品溶液的制备 称取少腹逐瘀汤组方药材粗粉465.0 g，按照当归∶川芎∶赤芍∶肉桂∶小茴香∶五灵脂∶没药∶蒲黄∶延胡索∶干姜(3∶1∶2∶1∶0.5∶2∶1∶3∶1∶1)比例配比，水煎煮提取2次，第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1.5 h，合并两次煎出液，浓缩至一定体积，取适量水煎液于60℃减压浓缩干燥得水煎液浸膏(SFZYD);另取一定体积水煎液用95%乙醇调至含醇量为80%，放置24 h，过滤沉淀，取上清液于60℃减压浓缩干燥得醇沉浸膏(SFA)。

图4 无水甲醇处理少腹逐瘀汤的HPLC图Fig.4 HPLC chromatograms of SFZYD dealt with methanol

图5 50%甲醇处理少腹逐瘀汤醇沉上清液的HPLC图Fig.5 HPLC chromatograms of SFA dealt with 50%methanol

图6 无水甲醇处理少腹逐瘀汤醇沉上清液的HPLC图Fig.6 HPLC chromatograms of SFA dealt with methanol

精密称取0.24 g水煎液浸膏粉末和0.16 g醇沉浸膏粉末(过三号筛)各2份，置具塞锥形瓶中，分别加入10 mL无水甲醇和50%甲醇，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，分别用溶剂补足减失质量，3 000 r/min离心10 min后，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

3.2 混合对照品溶液的制备 取没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、香草酸、香蒲新苷各对照品适量，精密称定，加甲醇配成质量浓度分别为 520、125、270、65、2 735、29、75 μg/mL的混合对照品贮备液。

4 方法学考察

4.1 线性范围的考察 将3.2项下配制的混合对照品溶液分别进样 2、5、10、15、20 μL，在上述色谱条件下进样分析测定。以进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程(结果见表1)，采用外标法计算样品中各成分量。

4.2 精密度实验 取3.2项下的混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，计算色谱峰面积的RSD值，结果见表2。

表1 线性关系考察结果(n=5)Tab.1 Results of linear relationship(n=5)

表2 方法学考察结果Tab.2 Results of method validation

4.3 重复性实验 精密称取0.24 g水煎液浸膏粉末6份，用无水甲醇按3.1项方法制备供试品溶液，进行定量测定，7个成分质量分数的RSD值结果见表2。

4.4 稳定性实验 取无水甲醇处理水煎液浸膏供试品溶液，分别于配制后 0、2、4、8、12 h 进行测定，计算各色谱峰面积的RSD值，结果见表2。

4.5 加样回收率 精密称取0.24 g水煎液浸膏粉末6份，各加入1 mL混合对照品溶液，用无水甲醇按3.1项下方法制备所需供试品溶液，测定，计算，结果见表2。

5 样品测定

取按3.1项下方法处理的供试品溶液各3份，进样10 μL，在上述色谱条件下测定，按外标法计算质量分数。色谱图见图2～6，结果见表3。

表3 不同样品中7个成分测定结果(n=3)Tab.3 Contents of the seven compounds in different samples(n=3)

6 讨论

6.1 样品处理方法的优化 本研究曾采用固相萃取柱进行处理，此法处理后样品有效成分损失较多，故选择无水甲醇和50%甲醇作为样品预处理方法，考察了不同处理方法对水煎液浸膏及醇沉浸膏中有效成分量的影响，结果表明:无水甲醇处理过的样品溶液中杂质峰干扰较小，有效成分量比50%甲醇处理过的稍高;醇沉浸膏中有效成分量较水煎液浸膏中的量高。

6.2 检测波长的选择 本实验选择的芍药苷、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸、香草酸、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷指标成分为少腹逐瘀汤中主要活性物质，但由于7个成分光谱差异较大，无法采用单一波长同时定量，故本实验采用多波长高效液相色谱法［9］，参考文献报道［7，10］，结合 7 种化合物的最大吸收波长和整体色谱图的特征，本方法选择了4个检测波长，分别为320 nm，270 nm，350 nm，230 nm，进行定量测定，方法较为客观准确，简便易操作，为方剂复杂效应成分的研究提供了一定的依据和参考。

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