新疆蓝莓中花青素的超声－微波提取及抗氧化活性研究

阿依努尔·阿不都如苏里， 努尔皮达·阿卜拉江， 迪丽努尔·马里克

（1.新疆教育学院科教学院，新疆乌鲁木齐830043；2.新疆师范大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830054）

新疆蓝莓中花青素的超声－微波提取及抗氧化活性研究

阿依努尔·阿不都如苏里1， 努尔皮达·阿卜拉江1， 迪丽努尔·马里克2

（1.新疆教育学院科教学院，新疆乌鲁木齐830043；2.新疆师范大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830054）

优选蓝莓中花青素的超声－微波提取工艺，并研究其抗氧化活性。以儿茶素为标准品，选取乙醇浓度、料液比、微波功率、提取时间等考察因素，以花青素提取率为指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验筛选出最佳的提取工艺条件。以VC为对照，通过清除羟自由基、DPPH·自由基和超氧阴离子自由基等实验来评价蓝莓中花青素体外抗氧化能力。乙醇浓度50%，液料比1∶60，超声功率50W，微波功率100W，提取时间180s时蓝莓中花青素的提取率最高，其含量达9.93%。蓝莓中花青素对羟自由基，DPPH·和超氧阴离子自由基都有一定清除能力。且在实验所选浓度范围内，抗氧化能力随浓度的增加而增强。

花青素；蓝莓；超声微波协同提取法；抗氧化活性

蓝莓（blueberry），属杜鹃花科，越橘属多年生落叶或常绿灌木。其果实含有花青素，尼克酸、黄酮、儿茶酸等多种酚类生理活性成分［1］。而且具有多种疾病防治及保健功能。尤其是果实中所含的花青素、儿茶酸等，有防治高血压、疏通毛细血管和缓解视疲劳的特殊功能［2－3］。花青素（Anthocyanidin），又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是植物花瓣中的主要呈色物质，水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分与之有关。主要由儿茶素单体及聚合体组合而成，是一种高活性、无毒副作用天然物质。其具有较强清除自由基、抗氧化能力及多种药理活性［4－5］。文章以蓝莓果实为研究对象，采用微波－超声波协同作用的方法对花青素的提取工艺进行研究，测定花青素粗提物对·OH和DPPH·的清除能力、还原能力以及超氧阴离子自由基的清除能力，为开发天然抗病毒物质提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓果实（采自新疆乌鲁木齐市南山区），儿茶素标准品，中国药品生物制品检定所；乙醇（95%）、盐酸（浓）、VC、亚硫酸铁、水杨酸、双氧水等，以上均为分析纯。1，1－苯基－2－苦肼基（DPPH），试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

日立U－3310紫外可见分光光度计（日本日立公司）、XH－300B型超声－微波组合合成／萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）、SHZ－D（III）循环水式真空泵（巩义市英峪子华仪器厂）、RE－52AA旋转蒸发器（上海亚荣生仪器厂）、电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的制备

称取12.5mg标准品（儿茶素）置于25mL的干燥容量瓶中，用甲醇定容至25mL其浓度为0.5mg／mL。分别精取1mL，2mL，3mL，4mL，5mL浓度为0.5mg／mL的标准品溶液用甲醇加至5mL，其浓度为0.1mg／mL，0.2mg／mL，0.3mg／mL，0.4mg／mL，0.5mg／mL。

1.3.2 显色剂的制备

准确称取0.5g香草醛置于50mL的容量瓶中用甲醇定容至50mL配成1%的香草醛溶液。

取12mL36%的浓盐酸用甲醇作溶剂配成8%的甲醇盐酸溶液。

用量筒称取20mL香草醛溶液置于烧杯中上面加入20mL的浓盐酸（香草醛溶液：盐酸溶液＝1：1）配置显色剂。

1.3.3 吸收波长的测定

精确称取1ml浓度为0.5mg／mL的标准品儿茶素溶液，再加入5mL香草醛－盐酸溶液，立即混匀在30℃避光条件下反应30min.接着利用紫外可见分光光度计在400nm～550nm区间扫描波长。其最大吸收波长为498nm（图1）。

图1 儿茶素的吸光度

1.3.4 标准曲线的绘制

根据魏福祥［6］等的方法用甲醇作溶剂配制花青素标准溶液浓度为1mg／mL。分别移取1、2、3、4、5 mL用甲醇定容至10 mL。各取1 mL另取1mL甲醇为空白液分别加入5 mL显色剂摇匀，避光。在30±1℃恒温水浴中保温30 min后取出在498 nm波长下测定其吸光值绘制花青素标准溶液的标准曲线（图2）得回归方程：y＝1.5211x+0.013，相关系数（R2＝0.9986）；

图2 儿茶素标准工作曲线

1.3.5 花青素样品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的粉碎过的蓝莓粉末1g于50mL圆底提取瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、功率、提取时间等条件下→浸泡→超声－微波提取→滤纸过滤→浓缩，充分洗净残渣，将洗涤液合并与提取液中→用甲醇定容至250mL得1～6号超声微波样品液→并用盐酸－香草醛溶液显色→紫外分光光度计含量测定。

1.3.6 工艺优化设计

1.3.6.1 单因素试验

分别以不同乙醇浓度、液料比、提取时间和功率为影响因素考察其对提取率的影响。

1.3.6.2 正交试验

在单因素实验的基础上选取提取剂浓度（A）、液料比（B）、微波功率（C）、提取时间（D）为四个考察因素，以花青素提取率为指标，选用L9（34）四因素三水正交表，正交试验设计见表1。

表1 因素水平表

1.3.7 抗氧化活性的测定

1.3.7.1 羟自由基清除率的测定

取7支试管各加入9 mmol／L的FeSO41mL，9 mmol／L的水杨酸－乙醇溶液1mL，样品1mL（浓度分别是0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6），再加入8.8 mmol／L的H2O21mL，放入37℃水浴中反应0.5h。以去离子水作为参比，空白组用去离子水代替样品。以VC（抗坏血酸）作为对照物，操作同上，在510nm处测定吸光度，重复做三次，取平均直代入下式计算清除率［7］。

式中，A0为空白吸光度值；A2为加入花青素后的吸光度值；A1为不加H2O2的花青素溶液吸光度值。

1.3.7.2 DPPH·清除能力的测定

吸取不同质量浓度的样品（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg／mL）2mL，移入试管中，加0.04 mmol／mL DPPH·的乙醇溶液2.0mL，置暗处30min，重复做三次。在517 nm波长处测定吸光度，以空白作参比，按下式计算清除率［8－10］。

式中，A0代表2mL DPPH·溶液加入2mL无水乙醇；Aj代表2mL待测液加入2mL无水乙醇吸光度；Ai代表2mL待测液加入2mL DPPH·溶液的吸光值。

1.3.7.3 清除超氧阴离子自由基的能力的测定

取50 mmol／L的Tris－HCl缓冲溶液（pH 8.2）4.5mL，加入4.2mL去离子水混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的3 mmol／L的邻苯三酚溶液0.3mL（以10 mmol／L的HCl代替邻苯三酚作为空白），混匀后立即倒入比色皿中，于420nm处每隔30s测定吸光度值1次，共测5min，计算对照溶液吸光度随时间的变化率A0。然后依上法实验，在加入邻苯三酚前先加入1.0mL花青素溶液，再加入3.2 mL去离子水，其余按上法操作，计算花青素溶液吸光度随时问的变化率Ax。将A0和Ax代入下式计算花青素溶液对超氧阴离子自由基的清除率。

式中，A0为空白的平均吸光度；Ax样品的平均吸光值。

2 结果与分析

2.1 提取时间对花青素提取率的影响

图3 提取时间对提取率的影响

由图3可知，在120s至240s时提取率随提取时间延长而逐渐升高，但当提取时间大于240s时，由于提取花青素与细胞内其它物质发生反应，使花青素含量降低，导致提取率下降。故提取时间以180s－300s较为合适。

2.2 乙醇浓度对提取率的影响

图4 乙醇浓度对提取率的影响

由图4可知，花青素提取率随乙醇浓度增大而升高，当乙醇浓度达50%后，提取率又开始缓慢下降，故选取乙醇浓度为40%－60%较为合适。

2.3 料液比对提取率的影响

图5 料液比对提取率的影响

由图5可知，花青素提取率随液料比增大而升高，当液料比达1：60后，提取率趋于下降趋势，这是因蓝莓果实中花青素含量有限，当提取剂达到一定比例后，花青素可能已完全浸出，再增加溶剂用量不仅不能增加提取量，反而会增加生产成本，所以选择液料比1：50－1：70为宜。

2.4 微波功率对提取率的影响

图6 微波功率对提取率的影响

由图6可知，花青素提取率随微波功率增大而缓慢升高，在120W时趋近于最大值，故选择提取功率为100W－140W间较为合适。

2.5 正交实验结果与方差分析

以花青素的提取率为指标，对表2所选定的考察因素做L9（34）正交试验，其结果见表3。

表2 L9（34）正交试验结果

表3 方差分析

由试验结果并通过极差R的大小可知，各试验因素对花青素提取率影响的大小次序为：提取时间（D）＞乙醇浓度（A）＞微波功率（C）＞料液比（B），即对蓝莓果实中花青素提取影响最大的因素是提取时间，其后依次为乙醇浓度、微波功率和料液比。根据K值的大小可知，最佳提取条件是：A2B2C1D1，即乙醇浓度50%，提取时间180s，料液比1：60，微波功率100w。

2.6 抗氧化实验结果

2.6.1 蓝莓花青素清除羟自由基的能力

图7 花青素与VC对羟自由基的消除率

利用Fenton反应，检测花青素和VC对羟自由基的清除作用，其结果如图7所示。在所选质量浓度范围内，花青素和VC对羟自由基都有一定的清除能力，其效果与添量呈正相关性。随着浓度的增大，对羟自由基清除率也增加，呈现出良好的量效关系。花青素和VC对羟自由基清除率的IC50值分别为0.13 mg／mL和0.35mg／mL，花青素对羟自由基的清除率比VC强约2.3倍。

2.6.2 蓝莓花青素清除DPPH·的能力

图8 花青素与VC对DPPH·的消除率

由图8可看出花青素和VC都对DPPH·自由基有一定的清除能力，而且其清除能力随着浓度的增加而增大。花青素和VC对DPPH自由基清除率的IC50值分别为0.13mg／mL和0.18mg／mL，蓝莓花青素对DPPH的清除率比VC强。

2.6.3 蓝莓花青素清除超氧阴离子自由基的能力

图9 花青素与VC对超氧阴离子自由基的清除率

蓝莓花青素对超氧阴离子自由基的清除作用由图9可看出花青素和VC都有一定的清除能力，而且其清除能力随着花青素浓度的增加而增大。蓝莓花青素和VC对超氧阴离子自由基清除率的IC50值分别为0.25mg／mL和0.3 mg／mL，花青素对超氧阴离子自由基的清除率稍强于VC。

3 结论

在单因素实验基础上，通过正交实验确定从蓝莓中提取花青素最佳提取工艺条件为：乙醇浓度50%，液料比1∶60，超声功率50w，微波功率100w，提取温度50℃，提取时间180 s；在此工艺条件下，蓝莓花青素提取率达到最大99.27mg／g即9.93%。抗氧化活性测定结果表明，花青素对羟自由基、DPPH·自由基、超氧阴离子自由基均有较好的清除能力，且在一定范围内对三者的清除作用呈现良好的量效关系。

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Study on Ultrasonic－microwave Synergistic Extraction and Antioxidantion of Anthocyanins from Blueberries

Aynur·ABDURUSUL1， Nurpida·ABLAJAN1， Dilnur·MALIK2
（1．Science and Education Institute，Xinjiang Education Institute，Urumqi，Xinjiang，830043，China；2．Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang Normal University，Urumqi，Xinjiang，830054，China）

Anthocyanins from blueberries were extracted by ultrasonic－microwave synergistic method and an⁃tioxidative activity was also studied.Using catechin as standard，the effects of different factors，such as ethanol con⁃centration，Solid－liquid ratio，microwave power as well as the extraction time were examined via single factor ex⁃periments towards yield of Anthocyanins blueberries.Besides，The antioxidative activities of the Anthocyanins were determined by hydroxyl free radical，DPPh free radical，superoxide anion free radical and reducing power.The or⁃thogonal experiment shows that the optimal conditions were as follows：ethanol concentration was 50%，solid－liquid ratio was 1：60 g／mL，ultrasonic power was 50W，microwave power was 100W and extraction time was 180s.The yield of total Anthocyanins was up to 9.93%through orthogonal experiments under these optimal conditions.Antiox⁃idant activity testing showed that the anthocyanins from blueberries had a certain scavenging activity on superoxide anion，DPHH·as well as·OH radicals.

Anthocyanins；Blueberries；Ultrasonic－microwave synergistic extraction；Antioxidant activity

Q946.1

A

1008⁃9659（2015）01⁃0084⁃07

2014－11－29

新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目（201423121）

阿依努尔·阿卜都如苏里（1969－），女，新疆阿克苏人，副教授，主要从事天然产物分离方面的研究。