不明原因不育患者精子头部空泡超微结构研究*

葛少钦葛雪凝赵峥辉王 燕△刘梅云

1. 河北大学（保定 071000）； 2. 河北大学附属医院；

3. 河北大学生殖医学研究所； 4. 河北省计划生育科学技术研究院

·研究简讯·

不明原因不育患者精子头部空泡超微结构研究*

葛少钦1-4葛雪凝1赵峥辉1王 燕1△刘梅云2△

1. 河北大学（保定 071000）； 2. 河北大学附属医院；

3. 河北大学生殖医学研究所； 4. 河北省计划生育科学技术研究院

研究表明，不孕不育夫妇数量正逐步增加［1］，据统计，全世界大约有15%～20%的育龄夫妇存在生育障碍，而男性原因导致不育的比例占40%～50%［2］。其中精子形态异常、精子畸形率增加是导致男性不育的重要原因［3］。当前许多学者试图从精子顶体畸形、精子DNA断裂与损伤、精子染色体异常等评价精子头部空泡与精子功能缺陷的关系［4］，但至今精子头部空泡分类并没有统一标准，空泡的本质尚属未知领域。本文利用透射电镜，观察正常生育力男性和不明原因不育患者精子头部空泡超微结构，对比常规电镜包埋材料与仅用戊二醛固定和醋酸铀染色处理的电镜材料，分析精子头部空泡化学组成，在一定程度上明确精子头部空泡对精子质量影响的本质，探讨不明原因性不育患者的不育原因。

材料与方法

一、受试对象

在河北大学附属医院生殖医学科随机选取25～45周岁不明原因的不育患者8例，无特殊病史，体格检查正常，无输精管阻塞、腮腺炎病毒感染、隐睾、营养不良、内分泌紊乱和精索静脉曲张等，精液液化正常，抗精子抗体阴性；女方皆为原发不孕，经妇科B超、子宫输卵管造影、内分泌水平、抗精子抗体、抗心磷脂抗体及抗内膜抗体检查，结果均正常；对照随机选取结婚2年、孕育有孩子的正常生育男性3例。

二、标本采集和处理

禁欲3～7d，室温约25～30℃的实验室，由供精者按摩取精。精液液化后，依据第五版《世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册》［5］标准行精液常规检查，剩余精液450×g，离心10min，沉淀精子用琼脂糖进行预包埋，一部分用于常规电镜材料处理（双染），另一部分用于戊二醛单固定和醋酸铀单染电镜材料处理（单染）。

（一）常规电镜材料处理（双染）

1. 前固定：琼脂糖预包埋精子放入装有适量前固定液1mL的小离心管中进行固定。固定液为2.5%多聚甲醛+0.1mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液，于4℃固定2h。

2. 漂洗：4℃下，0.1mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min。

3. 后固定：固定液为1%的锇酸+ 0.1mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液，于4℃固定1h。

4. 再漂洗：4℃下，0.1mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min。

5. 酒精系列脱水：在30%、50%、70%、85%、95%酒精中各10min，再在100%酒精、丙酮各两次，每次10min。

6. 渗透：环氧树脂Epon812与丙酮按1:1混合对材料进行渗透2h，然后转入纯环氧树脂Epon812渗透，过夜。

7. 包埋聚合：环氧树脂Epon812包埋，60℃聚合48h。

8. 超薄切片：半薄切片定位后，超薄切片（70～90）nm捞在铜载网上。

9. 双染：对材料进行醋酸铀、柠檬酸铅双重染色。

10. 漂洗：双蒸水漂洗3次，每次1min，自然干燥。

11. 观察：用JEM-100SX透射电镜（75kV）对材料进行观察，拍照。

（二）戊二醛单固定醋酸铀单染电镜材料处理（单染）

1. 前固定：琼脂糖预包埋精子放入装有适量前固定液的1ml的小离心管中进行固定。固定液：2.5%多聚甲醛+0.1mol/L pH 7.2的PBS缓冲液，于4℃固定2h。

2. 漂洗：4℃下，0.1mol/L pH 7.2的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min。

3. 酒精系列脱水：在30%、50%、70%、85%、95%酒精中各10min，再在100%酒精、丙酮各两次，每次10min。

4. 渗透：环氧树脂Epon812与丙酮按1:1混合对材料进行渗透2h，然后转入纯环氧树脂Epon812渗透，过夜。

5. 包埋聚合：环氧树脂Epon812包埋，60℃聚合48h。

6. 超薄切片：半薄切片定位后，超薄切片（70～90nm）捞在铜载网上。

7. 单染：对材料进行醋酸铀染色。

8. 漂洗：双蒸水漂洗3次，每次1min，自然干燥。

9. 观察：用JEM-100SX透射电镜（75kV）对材料进行观察，拍照。

结 果

依据第五版《世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册》［5］，精液参数参考值下限：精液体积1.5 mL，精子浓度15×106/mL，总活力［前向运动精子（PR）+非前向运动精子（NP）］ 40%，PR 32%，存活率58%，正常形态4%，pH≥7.2，液化时间（min）≤60，同时达到上述标准者为正常精液。

8例不明原因不育患者和3例正常生育力男性精液常规分析，其参数都在正常范围内（表1）；常规处理的电镜材料，精子头部空泡中清晰可见FP、膜螺旋体（MW）和髓样体（MB），颗粒物质与膜结构清晰，细胞核电子密度较高，顶体深染（图1AD）；仅用戊二醛固定、醋酸铀单染处理的电镜材料，精子头部空泡中无颗粒物质与膜型结构，细胞核电子密度低，顶体着色浅（图1E，图1F）。

表 1 8例不明原因不育患者和3例正常生育力男性精液分析结果

图1 电镜下观察不育患者精子头部空泡超微结构A-D为常规处理的电镜观察材料； E、F为仅用戊二醛固定、醋酸铀单染处理的观察材料； 其中A: 含有高电子密度絮状颗粒（FP）物质的无膜空泡和没有具体结构、无膜的小空泡（箭头所指）； B: 包含膜螺旋体（MW）和絮状颗粒FP内含物的空泡； C: 包含膜螺旋体MW空泡； D: 包含膜螺旋体MW与髓样体（MB）的空泡； E， F: 戊二醛固定和醋酸铀染色处理材料精子， 精子头部空泡（V）无膜结构（MW/MB）与FP， 内含物电子密度低

讨 论

精子的形态、结构和功能异常是男性不育的重要原因之一。精子形态学检查在辅助生殖技术中具有重要意义，第五版《世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册》对精子正常形态有严格的标准［5］。目前临床上一直把精液常规作为男性生殖学检查的一项重要而又基本的指标，鉴于其局限在光镜下观察，无法对精子结构和功能进行准确的判断。在临床精液分析中，特别是对于一些原因不明的不育症患者，常规精液分析参数正常并不能完全反映其疾病原因信息。透射电镜基于其高分辨率，能够清晰观察精子的各种超微结构，可对光学显微镜无法观察到的精子病变加以识别，在精子质量评价中，具有光镜无可比拟的优点，是目前精子形态与结构检测最客观可信的依据［5］。

精子结构完整性是其生殖功能的基础，精子形态及结构检查对临床男性不育的诊断、治疗和预后评价具有重要意义。通过对正常生育力男性和不明原因不育患者常规电镜处理材料研究观察，发现正常生育力男性精子头部长宽比例合适，质膜和顶体完整，线粒体排列有序，微管清晰可见9+2结构，头部无或有少量无具体结构的空泡（图2）；而不明原因不育患者精子头部空泡十分多发，且主要位于精子头部的前中区域，并存在异质性，按其超微结构可分为5种类型（图1A-D）：含有高电子密度絮状颗粒（Flocculent particles， FP）物质的无膜空泡；包含膜螺旋体（Membrane whorls， MW）和絮状颗粒FP内含物的空泡；包含膜螺旋体MW与髓样体（Myelinbody， MB）的空泡；仅包含膜螺旋体MW的空泡和没有具体结构、无膜的小空泡（箭头所指），这与Zhang等［6］的研究结果相一致。一般存在较大头部空泡的精子细胞核浓缩程度低且不再呈椭圆形结构，顶体凹凸欠平滑、肿胀或呈波浪形改变（图1A，图1C，图1D）。

图2 正常生育力男性精子常规电镜处理材料（A）与仅用戊二醛固定和醋酸铀染色处理材料（B）A: 精子头部长宽比例合适， 精子质膜和顶体完整， 细胞核存在一个结构较小的空泡， 尾部线粒体排列整齐， 微管清晰可见， 9+2结构完整； B:精子头部长宽比例合适， 精子质膜和顶体完整， 细胞核无空泡， 尾部线粒体排列整齐， 微管可见， 细胞核与顶体浅染

分析电镜材料的处理过程，各种试剂的搭配运用保证了对生物材料中糖、脂、蛋白质及核酸的充分固定与染色。其中戊二醛可固定糖，不固定脂；而锇酸可固定脂，不固定糖，两种固定剂都能固定蛋白质；醋酸铀对核酸物质及细胞膜染色效果好，而柠檬酸铅适用于对核糖体、糖原、细胞内物质染色，另外与含有还原锇的物质有强亲和力。只经过戊二醛单固定材料，在用酒精与丙酮脱水过程中，脂类物质将被抽提。我们将只经过戊二醛单固定和醋酸铀单染的材料（图2B；图1E，图1F）与常规电镜材料（图2A， 图1A-D）进行对比，发现正常生育力精子细胞核与顶体浅染，不明原因性不育精子头部空泡中均无脂质膜环层与髓样体，认为其中脂类物质在脱水过程中已经被抽提掉，仅存在相对高电子密度的蛋白颗粒物质，表明精子头部空泡包含了脂类、蛋白质类与核酸类物质。多种研究显示空泡的发生与精子形成晚期精-组蛋白替换不完全导致染色质浓缩异常有关［7，8］。精子空泡可能包含精子形成过程中本该移除的组蛋白、未参与DNA包装的精蛋白、调控精子发生及早期胚胎发育的非编码RNA（如lncRNA）等［9，10］。Garolla等［11-13］研究发现单独选择出的含有大空泡或几个大或小空泡的精子存在高水平的DNA损伤；Hammoud等［14］发现具有前部或后部空泡的正常精子（大小不定）比无空泡的正常精子的DNA断裂水平要高很多（前部空泡15.9%，后部空泡22.5% vs. 无空泡精子4.1%，前部P＜0.05，后部P＜0.001），表明空泡的大小和部位不同所提示的染色质浓缩异常程度和DNA断裂水平不一。研究已经证实大精子空泡与染色质浓缩失败紧密相关［8］，其可能造成高水平的精子DNA损伤，导致胚胎发育过程中父系基因组表达异常，无法在4～8细胞阶段完成对胚胎基因组的激活，使胚胎发育停滞等［15］，此外延时分析表明，与空泡精子发育成的囊胚相比，无空泡精子囊胚发育过程所需平均时间最短［16］。

尽管不同精子空泡的大小、数量和部位不同，其染色质浓缩异常程度不同，所造成的DNA损伤水平不一，会导致精子空泡与染色质浓缩异常关联程度的偏倚［12，14］，但电镜下发现不明原因不育患者精子头部空泡十分多发，提示其染色质浓缩失败，精子DNA存在一定程度的损伤，这可能是不明原因严重少弱精子症患者不育的原因之一。精子头部空泡多发将会降低受精率、妊娠率和胚胎质量，并诱发高流产率［7］，建议不明原因不育患者增加常规透射电镜精子检查项目，条件允许情况下可选择头部无或/少或/小空泡精子进行IMSI（Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection）辅助生殖技术。至于精子头部空泡中的具体脂质分类、蛋白质分布、核酸组成，空泡大小、多少及其存在部位等导致精子功能缺陷的阈值，精子头部空泡对受精、胚胎发育影响的分子机制等，尚有待于进一步研究。

不育，男性； 精子/超微结构

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（2015-06-13收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.014

R 698.2

资助: 河北省自然科学基金资助项目（编号：H2013201259）；河北省2013留学回国人员科研活动项目（编号：C2013005002）；国家第48批“留学回国人员科研启动基金”（编号：702850515001）

△通讯作者， 王燕， E-mail: wyry2004@163.com； 刘梅云， E-mail: lmydoctor2007@sina.com