PinX1基因的真核表达载体构建及其在乳腺癌细胞中的表达

姚乐申 袁毅路 李燕 张保国

PinX1基因的真核表达载体构建及其在乳腺癌细胞中的表达

姚乐申 袁毅路 李燕 张保国

目的 进一步研究端粒结合蛋白PinX1基因在乳腺癌细胞中对端粒酶活性的调控作用，构建PinX1基因的真核表达载体，转染乳腺癌MDA-MB-231细胞，表达并鉴定其编码蛋白PinX1。 方法 采用RT-PCR法扩增PinX1基因的编码序列，将其克隆至pMD18-T载体中构建T-PinX1质粒，NOT1和Xhol1双酶切T-PinX1质粒与PUB6/V5-HISA载体后，连接并构建真核表达载体PUB6/V5-HIS A-PinX1，采用序列分析鉴定阳性质粒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞，采用Western blot鉴定PinX1蛋白的表达。 结果 经酶切、序列分析鉴定证实成功构建PinX1基因的真核表达载体；Western blot检测结果证实，成功完成了该表达载体在乳腺癌MDA-MB-231细胞内的特性外源性表达。 结论 本研究成功构建了PinX1基因的真核表达载体，并完成了该表达载体在乳腺癌MDAMB-231细胞内的特性外源性表达。为后期进一步研究PinX1基因在乳腺癌发生发展中的作用及PinX1蛋白表达与乳腺癌预后的关系奠定了基础。

乳腺癌；PinX1基因；真核表达；MDA-MB-231细胞

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤。流行病学资料显示，近年来，乳腺癌的新增病例数逐年上升，现已成为老年女性最常见的一种恶性肿瘤之一，严重影响老年妇女身心健康甚至危及生命［1］。虽然近年来对乳腺癌的病因学研究不断深入，但由于其病因及发病机制复杂，故至今仍未真正探明［2-4］。研究认为遗传易感性、内分泌以及生活、饮食习惯等因素都可能与乳腺癌的发生相关。

研究已证实肿瘤细胞中端粒酶活性显著增高［5］，已知端粒酶活性受多种途径调控，其中端粒结合蛋白PinX1是研究者近年来发现的一个重要的调控蛋白［6］。PinX1可直接与端粒酶逆转录酶hTERT结合，发挥其端粒酶活性的抑制因子作用。同时，实验证实抑制PinX1蛋白的表达可显著促进细胞的癌变，由此推测PinX1可能是一个重要的抑癌因子［7］。

然而，端粒结合蛋白PinX1基因在乳腺癌细胞中对端粒酶活性的调控作用，及其在乳腺上皮细胞癌变过程中的作用机制目前尚不明确。为进一步探讨PinX1对乳腺癌细胞活性的调节及其分子机制，进而研究PinX1基因在乳腺细胞癌变过程中的作用机制，本研究构建了PinX1基因的原核表达载体，并在乳腺癌MDA-MB-231细胞系进行了表达和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌DH5α、乳腺癌MDA-MB-231细胞系、肝癌细胞系HepG2、pMD18-T载体以及pUB6/ V5-His A细胞工程重组质粒（HIS-tag）均由中国药科大学药学实验室惠赠。

1.2 实验试剂 一步法逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）试剂盒、总RNA抽提试剂盒、Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒、Opti-MEM无血清培养基购自Invitrogen公司（美国）；pMD18-T Simple Vector试剂盒、限制性内切酶NOT 1及Xhol1、PCR产物凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒及T4连接酶试剂盒购自Takara公司（日本）；高糖DMEM培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司（美国）；兔抗HIS一抗购自Abcam公司（英国）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗购自中杉金桥公司；其余实验用试剂均为分析纯。

1.3 肝癌细胞系HepG2总RNA的提取 参照Invitrogen公司 RNA抽提试剂盒使用说明方法提取HepG2细胞总RNA，并将其稀释到1μg/μl质量浓度，待下一步实验用。

1.4 引物设计 根据GenBank数据库中PinX1基因的核酸序列（GI：547235253）设计扩增用上、下游引物，为便于将扩增序列插入表达载体，分别引入NOT1 和Xhol1酶切位点。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。序列如下：

上游引物：5′-TTGCGGCCGCAA ATGTCTATGCTGGCTGAACG-3′

下游引物：5′-CCCTCGAGGG TTGGAATCTTTCTTCTTCTTCT-3′

斜体部分分别为NOT1和Xhol1酶切位点。预期PCR扩增产物为 PinX1基因全长，片段长度约为926 bp。

1.5 RT-PCR法扩增PinX1基因 以提取的HepG2细胞总RNA为模板，采用逆转录一步法扩增PinX1基因全长，扩增体系参照Invitrogen公司RT-PCR试剂盒说明书。反应条件：52℃ 20 min，95℃ 5 min，95℃30 s，54℃ 30 s，70℃ 30 s，40个循环；70℃延伸10 min，25℃ 1min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测、分离PCR扩增产物。

1.6 T-PinX1重组质粒构建 参照Takara公司凝胶回收试剂盒说明书，回收阳性PinX1基因PCR产物，按照T-A连接原理将其连接pMD18-T载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，利用氨苄霉素抗性进行筛选，挑取单个菌落扩增后抽提质粒，分别进行PinX1引物PCR及NOT1和Xhol1双酶切鉴定，鉴定均为阳性的重组质粒命名为T-PinX1质粒。

1.7 PUB6/V5-HIS A-PinX1真核表达载体的构建采用限制性内切酶NOT1和Xhol1双酶切法，对重组质粒T-PinX1进行消化，同时采用NOT1和Xhol1双酶切HIS-tag PUB6/V5-HIS A真核表达载体质粒，纯化酶切产物。并用T4DNA连接酶，连接酶切产物与表达载体，16℃连接4 h，连接产物转化大肠杆菌感受态细菌DH5α，在氨苄青霉素抗性的平板上筛选生长，涂板后挑取单菌落扩增。抽提质粒分别进行PinX1引物PCR及NOT1和Xhol1双酶切鉴定，鉴定阳性的重组质粒进行基因序列分析，正确的质粒命名为PUB6/ V5-HISA-PinX1。

1.8 转染乳腺癌 MDA-MB-231细胞 采用高糖DMEM，体外培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将构建的重组PUB6/V5-HIS A-PinX1质粒转染细胞，转染体系：200μl的无血清 Opti-MEM培养基、10μl Lipofectamine-2000转染试剂及10μg重组质粒DNA，混匀静置5 min后加至MDA-MB-231细胞无血清培养体系中，37℃孵育6 h，以含10%FBS的高糖DMEM培养体系替换转染混合物。培养箱内常规培养48 h后收集细胞。同时设空白对照组及空载体转染对照组。

1.9 PinX1蛋白鉴定 采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测转染后MDA-MB-231细胞内PinX1蛋白的表达情况。SDS-PAGE蛋白电泳后，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜，5%的脱脂牛奶过夜封闭。抗体孵育：一抗采用1∶500的兔抗HIS，4℃ 过夜孵育，二抗采用1∶5000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温2 h。用化学发光蛋白免疫印迹（ECL）法显色分析。

2 结果

2.1 RT-PCR法扩增PinX1基因全长 采用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物片段，鉴定结果显示，在约900 bp处可见特异性目的条带，其大小与PinX1基因预期相一致（图1）。

图1　PinX1基因RT-PCR产物片段琼脂糖电泳图

2.2 T-PinX1质粒鉴定 分别采用PinX1特异性引物PCR及NOT1和Xhol1双酶切的方法鉴定T-PinX1质粒。在含氨苄青霉素的LB平板上，挑取了5个单克隆进行PinX1特异性引物PCR鉴定，结果5个单克隆均为阳性（图2），随机取其中一个单克隆摇菌扩增后进行双酶切鉴定，产物条带在900 bp左右（图3）。结果表明PinX1基因片段成功克隆到pMD18-T载体上。

图2　PinX1特异性引物PCR鉴定

图3　T-PinX1双酶切PCR鉴定

2.3 PUB6/V5-HIS A-PinX1真核表达载体的鉴定分别采用PinX1特异性引物PCR及NOT1和Xhol1双酶切的方法鉴定PUB6/V5-HIS A-PinX1质粒。在氨苄青霉素抗性的LB平板中，挑取10个单克隆进行TPinX1引物PCR鉴定，结果其中8个单克隆为阳性（2，3，5-10）（图4）。随机选取其中1个阳性克隆摇菌扩增后提取质粒用NOT1和Xhol1双酶切，有约900 bp目的条带（图5）。将质粒进行DNA序列分析，测序结果与GenBank数据库中PinX1基因（GI：547235253）的核酸序列完全一致。结果证实已将PinX1基因成功克隆至 PUB6/V5-HIS A载体中，真核表达质粒PUB6/V5-HISA-PinX1构建成功。

图4　PUB6/V5-HISA-PinX1质粒PCR鉴定

图5　PUB6/V5-HISA-PinX1质粒NOT1和Xhol1双酶切鉴定

2.4 免疫印迹法鉴定PinX1蛋白表达 本研究中选用的 PUB6/V5-HIS A载体带有 HIS-tag，故乳腺癌MDA-MB-231细胞转染PUB6/V5-HIS A-PinX1后，表达的重组PinX1蛋白可被抗His特异性抗体所识别。经Western blot检测，转染后MDA-MB-231细胞表达的PinX1蛋白大小与预期相一致（35kD），而空载体与空白对照组均无条带，表明PinX1蛋白在乳腺癌MDAMB-231细胞中得到有效表达（图6）。

图6　免疫印迹法法检测PUB6/V5-HISA-PinX1在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

3 讨论

全球肿瘤流行病统计数据（GLOBOCAN）认为乳腺癌是中国女性最常见的癌症，年龄标化率（ASR）为每10万人 21.6例［8］。根据中国国家肿瘤登记中心的数据，乳腺癌是城市女性最常见的癌症，是农村女性第四大常见癌症。乳腺癌的发病机制至今仍不明确，相关病因学研究已引起研究者们的高度重视。大量研究结果表明端粒酶在恶性肿瘤的演变过程中有重要作用，且其表达水平与肿瘤的预后密切相关［9］。PinX1基因作为端粒酶的抑制基因，定位于8p23，近年来被认为是一种细胞内在的端粒酶抑制因子，其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。已有研究证实在肠癌、胃癌等肿瘤患者中PinX1表达显著下降，端粒酶活性显著增强［10］。因此，PinX1被认为是潜在抑癌因子。

本研究选用表达真核载体PUB6/V5-HIS A，通过基因重组方法，采用NOT1和Xhol1对PinX1片段的PCR产物及PUB6/V5-HISA表达载体分别双酶切，使核酸片段和表达载体具有互补的黏性末端，可保证PinX1目的片段定向插入至PUB6/V5-HIS A表达载体。本研究成功构建了PinX1基因的真核表达载体，并通过脂质体将AVI-PUB6/V5-HIS A-PinX1重组质粒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞，实现了PinX1蛋白在乳腺癌细胞中的特异性外源表达，为进一步研究PinX1蛋白在乳腺癌发生发展中的作用及PinX1蛋白与乳腺癌预后关系的研究奠定了基础。

［1］ Fan L，Strasser-Weippl K，Li JJ，et al.Breast cancer in China［J］.TheLancet Oncology，2014，15（7）：e279-e289.

［2］ Fresco R，Spera G，Meyer C，et al.Imaging radiation doses and associated risks and benefits in subjects participating in breast cancer clinical trials［J］.Oncologist，2015，20（7）：702-712.

［3］ Kaushal N，DurmazYY，BaoL，et al.“Smart”nanoparticles enhance the cytoplasmic delivery of anti-rhoc silencing rna and inhibit the migration and invasion of aggressive breast cancer cells［J］.Mol Pharm，2015，12（7）：2406-2417.

［4］ Koh CH，Bhoo-Pathy N，Ng KL，et al.Utility of pre-treatment neutrophil-lymphocyte ratio and platelet-lymphocyte ratio as prognostic factors in breast cancer［J］.Br JCancer，2015，113（1）：150-158.

［5］ Rana C，Piplani H，Vaish V，et al.Downregulation of telomerase activity by diclofenac and curcumin is associated with cell cycle arrest and induction of apoptosis in colon cancer［J］.Tumour Biol，2015，36（8）：5999-6010.

［6］ Tian XP，Qian D，He LR，et al.The telomere/telomerase bindingfactorPinX1regulatespaclitaxelsensitivity depending on spindle assembly checkpoint in human cervical squamous cell carcinomas［J］.Cancer Letters，2014，353 （1）：104-114.

［7］ Mei PJ，Chen YS，Du Y，et al.PinX1 inhibits cell proliferation，migration and invasion in glioma cells［J］.Med Oncol，2015，32（3）：73.

［8］ Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［9］ Zuo J，Wang DH，Zhang YJ，et al.Expression and mechanism of PinX1 and telomerase activity in the carcinogenesis of esophageal epithelial cells［J］.Oncol Rep，2013，30 （4）：1823-1831.

［10］Wang HB，WangWQ，Wang XW，et al.PinX1 gene transfection enhances the sensitivity of gastric carcinoma cell line to 5-fluorouracil［J］.Hepatogastroenterology，2011，58 （106）：682-686.

Construction of recombinant eukaryotic expression and identification of PinX1 in human breast cancer cell line

YAO Le-shen，YUAN Yi-lu.Department ofGeneral Surgery，Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China；LI Yan.Jiangsu Provinicial Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210009，China；ZHANG Bao-guo.Department of Oncology，Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China

Objective To observe the effect of PinX1 gene on the regulation of telomerase activity of breast carcinoma cell line by constructing the full-length PinX1 gene into an eukaryotic expression vector，and to identify the coding protein expression in human breast cancer MDA-MB-231 cell line. M ethods The coding sequence of PinX1 was amplified by one step RT-PCR and cloned into pMD18-T vector to construct T-PinX1 plasmid.NOT1 and Xhol1 digested TPinX1 plasmid and the vector of PUB6/V5-HIS A，then the recombinant eukaryotic expression vector PUB6/V5-HIS APinX1 was constructed，and transfected into breast cancer MDA-MB-231 cells.The expression of the PinX1 gene in MDAMB-231 cellswas identified by Western blot. Results The recombinant eukaryotic expression vector PUB6/V5-HISAPinX1 was successfully constructed.The expression of PinX1 gene was detected by Western blot. Conclusions The PinX1 gene recombinant eukaryotic expression vector has been successfully constructed and expressed in human breast cancer cells.This work would lay a foundation for further study on the function of PinX1 protein and its interaction with other proteins in breast cancer.

breast cancer；PinX1 gene；eukaryotic expression；MDA-MB-231 cell line

R 655.8

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.12.010

2015-05-20）

210008 江苏省南京市，南京大学医学院附属鼓楼医院普外科（姚乐申，袁毅路）；210009江苏省南京市，江苏省疾病预防控制中心（李燕）；210006江苏省南京市，南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）肿瘤科

张保国，Email：emily88127@126.com