XIAP在胃癌组织中的表达及临床意义研究

杨丽丽

现有研究已经证实细胞凋亡过程与凋亡基因表达关系密切［1-3］, 测定细胞凋亡基因表达具有重要意义。XIAP作为新型细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员, 能够与Caspase-3、Caspase-9等直接发生相互作用, 对细胞凋亡具有显著抑制效果。本研究通过分析总结胃癌组织XIAP和基因的表达特点, 为胃癌诊治提供新思路, 现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年6月～2016年8月因胃癌而于本院接受手术治疗的76例患者, 将术中获取的76份胃癌组织作为胃癌组, 50份癌旁正常组织作为正常组。入选标准：①病理检查证实为胃部恶性肿瘤；②患者知情同意；③肿瘤组织保存完整；④排除拒绝参加实验者；⑤排除有其他不适宜因素者。其中男48例, 女28例；年龄35～76岁, 平均年龄(61.35±6.07)岁；组织学分化等级为低分化35例, 中分化21例, 高分化20例。选取同期资料相仿、病例检查确诊为胃部良性病变的60例患者, 活检获取的60份胃良性病变组织作为胃良性病变组, 其中男41例, 女19, 年龄34～78岁,平均年龄(58.62±6.46)岁。

1.2 试剂和仪器 兔抗人XIAP单克隆抗体(一抗)、SP检测试剂盒、DAB显色试剂、显微镜电泳仪、其他免疫组化检测相关试剂、RT-PCR检测相关试剂、PCR分析软件等。

1.3 方法

1.3.1 XIAP测定方法 组织脱蜡水化后用过氧化物酶阻滞剂在避光条件孵育15 min, 取出蒸馏水冲洗后用磷酸缓冲盐(PBS)溶液浸泡并湿盒；加入一抗1000 ml于组织上, 再次孵育30 min, 取出后再用PBS溶液浸泡并湿盒, 添加100 ml体积Chem MateTMEnvusion/HRP溶液在组织上后再孵育30 min, 取出后再用PBS溶液浸泡并湿盒, 向组织表面滴加DAB显色剂100 ml, 完全显色之后, 用蒸馏水将显色剂冲洗干净以终止显色反应, 对显色成功的标本进行梯度酒精脱水(从70%酒精开始至100%酒精结束), 将标本放置到二甲苯溶液中浸泡3次后, 取出再次脱水并用中树胶封片后行镜下染色结果观察。

1.3.2 XIAP mRNA测定方法 以逆转录方式分别提取总RNA后, 通过逆转录酶、相应六聚体引物将RNA样本进行反转录, 利用XIAP特异性引物对样本进行PCR反应获取PCR扩增产物以得到 XIAP mRNA。用琼脂糖胶将扩增产物分离后, 将待测物质放置于EB溶液中进行显色反应, 在紫外灯照射条件下, PCR扩增产物放置到电泳仪中完成电泳扫描, 从而对各组的目的基因、β-actin光密度值进行测定, 将电泳结果输入PCR分析系统进行分析, 计算 XIAP灰度积分、条带背景灰度积分及β-actin灰度积分, 其中目的基因相对表达强度=(目的基因灰度积分-条带背景灰度积分)÷(βactin灰度积分-条带背景灰度积分)×100%。

1.4 观察指标及判定标准 观察比较三组XIAP和XIAP mRNA表达水平。本研究中阳性对照为用已知阳性胃癌切片,阴性对照用PBS溶液对一抗进行替代。XIAP阳性标准［3］：在显微镜下观察到细胞质内出现特异性黄色或棕黄色颗粒、且细胞核未见着色。根据阳性细胞数、染色程度, 参照文献［4］客观评价XIAP阳性强度并计算阳性率, 染色程度计分方法为：无色：0分, 为阴性, 浅黄色：1分, 棕黄色：2分,棕褐色：3分；根据阳性细胞百分率(每个视野计数100个细胞, 计算阳性细胞所占比例, 每张标本均计数5个视野,取平均值为结果, 分数越高, 阳性细胞百分率越大。无阳性细胞：0分, 0＜阳性细胞百分率≤10%：1分；10%＜阳性细胞百分率≤50%：2分；50%＜阳性细胞百分率≤75%：3分；阳性细胞百分率＞75%：4分)；染色强度评分乘以阳性细胞百分率所获得乘积为评价标本阳性结果的依据, 乘积＞3分为阳性, 乘积≤3分为阴性。本实验采取双盲法阅片。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件对研究数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

胃癌组XIAP免疫组化评分(6.54±1.08)分, 56份标本XIAP阳性, 阳性率为73.68%, XIAP mRNA表达量为(3.16±0.27)；正常组XIAP免疫组化评分为(2.61±0.34)分, 11份标本XIAP阳性, 阳性率为22.00%, XIAP mRNA表达量为(1.09±0.18)；胃良性病变组XIAP免疫组化评分为(2.56±0.41)分,8份标本XIAP阳性, 阳性率为13.33%, XIAP mRNA表达量为(1.15±0.16)；胃癌组XIAP免疫组化评分、XIAP阳性率、XIAP mRNA表达量显著高于其他两组, 差异具有统计学意义(P＜0.01)；正常组、胃良性病变组XIAP免疫组化评分、XIAP阳性率、XIAP mRNA表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

XIAP属于IAP家族之一, 在1996年被有关学者等首次从人胚胎脑细胞中成功克隆, 人体中仅有外周血淋巴细胞未见明显XIAP表达, 其他组织中均可检测到XIAP。细胞学研究表明XIAP能够参与细胞增殖过程, 对细胞分裂速度产生直接影响。现有研究中关于胃癌XIAP的研究并不少见［5-7］,但是目前仍无相关大样本研究明确胃癌XIAP表达在胃癌诊治中的价值。本研究结果显示, 胃癌组织中XIAP、XIAP mNRA表达显著高于正常组织和胃良性病变组织, 且正常组织与胃良性病变组织中XIAP、XIAP mNRA表达水平相近,说明XIAP作为抗凋亡因子在胃癌中具有异常高表达特性,其可能与胃癌细胞存在凋亡障碍有关［8-10］, 其能够通过抑制胃癌细胞凋亡而延长胃癌细胞存活时间, 从而加速胃癌恶化。不同病理特征胃癌组织中XIAP表达水平分析结果发现, 临床分期越晚, 胃癌组织中的XIAP阳性率越高, 证实XIAP参与胃癌恶化进展。由于研究时间、样本数目等限制, 未能对XIAP在胃癌恶化中的具体机制进行明确。

综上所述, XIAP可能参与胃癌发生及恶化进程, 测定XIAP水平对恶性肿瘤诊治准确性的提升有重要价值。

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