γ-干扰素对大鼠肾成纤维细胞增殖及单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

罗 军 袁红伶 徐 剑 吕 琴

(昆明理工大学附属医院，云南 昆明 650032)

肾间质纤维化是多种病因引起的肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共同病理过程，其主要特点为肾小管扩张或萎缩、间质区大量炎症细胞的浸润、细胞外基质(ECM)生成降解失衡及组织微血管损伤等。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1可使炎症因子向肾间质聚集，导致局部微炎症的发生，从而加重肾间质纤维化，抑制炎症因子的释放与表达能有效缓解肾间质纤维化的进程。本研究观察不同浓度干扰素(IFN)-γ对大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)增殖及MCP-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1一般材料 NRK-49F细胞株(ATCC)购于中南大学湘雅医学院，IFN-γ购于上海凯茂生物医药有限公司，NRK-49F细胞培养试剂与RT-PCR试剂盒购于云南杰美科技有限公司，兔抗鼠MCP-1抗体与兔抗鼠β-actin一抗购于美国Abcam公司，十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)配制试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗及蛋白Marker购于北京鼎国公司。

1.2仪器 Forma3111型CO2细胞培养箱(Forma scientific公司)、基因扩增仪GeneAmp PCR System 9700(上海宏润医疗设备有限公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度计(赛默飞世尔科技)、Sigma 960酶标仪(Metertech公司)、BG-Power 600i百晶电泳仪(北京百晶生物技术有限公司)、ChemidocXRS化学发光成像系统(Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1NRK-49F细胞培养 培养条件为5%CO2、37℃条件下在细胞培养箱中常规培养，培养基根据细胞种类采用含12%胎牛血清的高糖DMEM培养液。细胞以1×106/ml接种于25 cm2培养瓶中，传代如常。

1.3.2不同终浓度的 IFN-γ对NRK-49F细胞进行干预 将细胞接种于96 孔板，次日细胞贴壁后，换为含12%胎牛血清的DMEM 高糖培养基继续培养24 h后，逐孔加入不同浓度的IFN-γ，使其终浓度分别为1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml，加入等剂量0.9%的生理盐水作为对照，每组IFN-γ浓度设定5个复孔，另外1个不加细胞只加等量的培养基作为调零孔，共31孔。分别培养12 h、24 h 及36 h 后，在每孔中加10 ml四甲基偶氮唑蓝(MTT，5 mg/ml)，继续培养4 h，每孔加入 100 ml三联裂解液，振荡15 min，用酶标仪以570 nm波长比色，记录光密度(OD)值。

1.3.3RT-PCR检测MCP-1 mRNA表达 将细胞接种于6孔板，次日细胞贴壁后，换为含12%胎牛血清的DMEM 高糖培养基继续培养24 h后，逐孔加入终浓度为1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ，加入等剂量0.9%的生理盐水作为对照。Trizol法提取细胞总RNA，逆转录后，分别进行MCP-1及GADPH扩增。MCP-1引物序列设计根据NCBI基因数据库中mRNA序列，利用引物设计软件Primer5.0进行设计，采用GADPH作为内参，引物均由上海生工合成，MCP-1引物上游序列：5′-CAA TGA GTC GGC TGG AGA-3′，下游序列：5′-GCT TGA GGT GGT TGT GGA-3′，扩增片段242 bp；GADPH引物上游序列：5′-TAG CCC AGG ATG CCC TTT ATT-3′，下游序列：5′-CCC CCA ATG TAT CCG TTG TG-3′，扩增片段195 bp。逆转录反应体系为20 μl，反应条件为：42℃ 60 min；70℃ 5 min，共1个循环；PCR扩增体系为10 μl，MCP-1：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s共35个循环，之后72℃延伸10 min，最后4℃无穷；GADPH：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s共35个循环，之后72℃延伸10 min，最后4℃无穷。取5 μl PCR反应产物，采用2%琼脂糖凝胶，于80 V恒压电泳30 min，在化学发光成像仪显影，采集图片并分析数据。

1.3.4Western印迹检测MCP-1蛋白表达 常规培养6孔板细胞长至 85%～95%时，加入1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ 200 μl干预24 h，另外设置一个加入等剂量的0.9%生理盐水作为对照组。蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，分别等量点样于10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳后，电转膜，封闭，将一抗MCP-1(1∶10 000)，β-actin(1∶10 000)置于4℃过夜，洗膜，二抗(1∶10 000)孵育，电化学发光法(ECL)发光，X线显影定影。Quatity One软件进行灰度分析

1.4统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1IFN-γ对NRK-49F细胞增殖的影响 随着诱导时间延长，NRK-49F活细胞数目逐渐增多，即促进能力越强(P<0.05)，但IFN-γ对NRK-49F细胞的促进作用与其浓度无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 IFN-γ对NRK-49F细胞增殖的影响值)

与同时点对照组比较：1)P<0.05；与同浓度IFN-γ前一时点比较：2)P<0.05；下表同

2.2IFN-γ对NRK-49F细胞MCP-1 mRNA表达的影响 IFN-γ可上调NRK-49F细胞MCP-1 mRNA表达水平，且呈时间依赖关系(P<0.05)，但与浓度相关性不大(P>0.05)。见图1，表2。

1～6:对照组、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml组，下图同图1 各组NRK-49F细胞MCP-1 mRNA表达水平

2.3IFN-γ对NRK-49F细胞MCP-1蛋白表达的影响 与对照组(1.454±0.447)相比，1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml IFN-γ能促进NRK-49F细胞表达MCP-1蛋白(1.383±0.528、1.679±0.764、0.742±0.107、1.427±0.079、0.607±0.094，P<0.05)，但和IFN-γ浓度无关(P>0.05)。见图2。

表2 IFN-γ对NRK-49F细胞MCP-1 mRNA表达影响

图2 各组NRK-49F细胞MCP-1蛋白表达

3 讨 论

IFN-γ是致炎作用很强的细胞因子，在机体炎症反应过程(包括迟发超敏反应、炎症、排斥反应等)中起着非常重要的作用〔1〕。C-jun氨基末端激酶(JNK)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中重要的通路之一，主要影响细胞凋亡、炎症及肿瘤等病理形态〔2〕。JNK信号通路的活化是通过其氨基末端残基磷酸化来实现的，激活之前分布于细胞质中，一旦被激活，细胞质中的JNK会迅速转移到细胞核中，增强转录因子蛋白的转录活性，从而促进凋亡蛋白(AP)-1的表达〔3〕。研究表明IFN-γ主要通过激活JNK信号通路，活化的JNK进入细胞核，使转录因子AP-1蛋白活性增强，促使DNA表达MCP-1，MCP-1又会介导炎症因子的聚集，从而加快了炎症的进展〔4，5〕。MCP-1是一种重要的特异性细胞趋化因子，具有趋化单核细胞和巨噬细胞的功能，在脏器纤维化的过程中具有重要作用〔6〕。在肾间质纤维化进程中，MCP-1主要趋化巨噬细胞浸润肾间质，在ECM的合成与分泌发挥重要作用〔7〕。抑制MCP-1的表达可阻止肾间质巨噬细胞浸润，改善肾间质局部微环境，减少ECM的合成，从而改善和延缓肾间质纤维化的进程〔8〕。本研究结果显示IFN-γ对NRK-49F细胞的增殖具有促进作用，这与刘海林等〔9，10〕结果类似。出现这一与实验预期相反的结果，研究组初步认为这可能与NRK-49F细胞系本身有关，NRK-49F细胞系本身为活化的细胞，其表现出活化后的诸多特性，而IFN-γ只能抑制未活化的NRK-49F的增殖，对活化的NRK-49F却产生相反的作用。

通过进一步实验证实：不同终浓度的IFN-γ干预NRK-49F细胞MCP-1的表达较对照组明显升高，MCP-1在肾间质纤维化的发生、发展中表现为正调控，这表明IFN-γ在体外细胞实验无抗肾间质纤维化的特性。出现这一结果研究组认为存在以下原因：NRK-49F细胞株本身就是活化的细胞，IFN-γ只能对尚未活化的肾间质成纤维细胞起作用，对于已活化的NRK-49F细胞反而其促进增殖作用；IFN-γ本身具有抗肾间质纤维化的特性，但在体外单一细胞环境下，IFN-γ抗肾间质纤维化的特性没有被激发；NRK-49F细胞在IFN-γ的干预下，可能引起NRK-49F细胞免疫反应，从而活化了NRK-49F细胞，表现诸多促进肾间质纤维化的性质；IFN-γ根本不具备抗肾间质纤维化的特性，而是表现促肾间质纤维化的性质。体内研究与体外细胞实验存在巨大的差异，IFN-γ在体内是否具有抗肾间质纤维化的特性，仍需大量的动物实验与临床研究来证实。

1Rubio-Perez JM，Morillas-Ruiz JM.A review：inflammatory process in Alzheimer′s disease，role of cytokines〔J〕.Sci World J，2012；(6)：756357.

2Davies C，Tournier C.Exploring the function of the JNK (c-Jun N-terminal kinase) signalling pathway in physiological and pathological processes to design novel therapeutic strategies〔J〕.Biochem Soc Transact，2012；40(1)：85.

3Whitham M，Chan MHS，Pal M，etal.Contraction-induced interleukin-6 gene transcription in skeletal muscle is regulated by c-Jun terminal kinase/activator protein-1〔J〕.J Biol Chem，2012；287(14)：10771-9.

4Zhu X，Liu J，Gao Y，etal.ATP-sensitive potassium channels alleviate postoperative pain through JNK-dependent MCP-1 expression in spinal cord〔J〕.Int J Mol Med，2015；35(5)：1257-65.

5Viedt C，Dechend R，Fei J，etal.MCP-1 induces inflammatory activation of human tubular epithelial cells：involvement of the transcription factors，nuclear factor-κB and activating protein-1〔J〕.J Am Soc Nephrol，2002；13(6)：1534-47.

6Lloyd CM，Minto AW，Dorf ME，etal.RANTES and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) play an important role in the inflammatory phase of crescentic nephritis，but only MCP-1 is involved in crescent formation and interstitial fibrosis〔J〕.J Exp Med，1997；185(7)：1371-80.

7Morii T，Fujita H，Narita T，etal.Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy〔J〕.J Diab Compl，2003；17(1)：11-5.

8Humphreys BD，Xu F，Sabbisetti V，etal.Chronic epithelial kidney injury molecule-1 expression causes murine kidney fibrosis〔J〕.J Clin Invest，2013；123(9)：4023.

9刘海林，陆汉明，李定国，等.α、γ-干扰素对人成纤维细胞的生长和胶原合成的影响〔J〕.上海交通大学学报(医学版)，1997；17(3)：226-7.

10刘海林，杨少平，李定国.细胞因子在肝纤维化中的作用〔J〕.中华消化杂志，1994；14(3)：172.