过表达Runx2基因对牙髓细胞分化相关基因的影响

唐小雪 周 政 王 洋 高 芸 李 琦

(石河子大学医学院第一附属医院口腔科，新疆 石河子 832008)

牙髓组织具有很强的自我修复能力，当受到外界损伤刺激时发挥自我更新作用。牙齿受到轻微刺激如磨耗等会促进成牙本质细胞生成反应性牙本质，但受到严重的刺激时诱导牙髓周围的成牙本质细胞凋亡〔1，2〕。目前普遍认为，牙髓细胞中未分化的干细胞或者祖细胞可分化形成成牙本质细胞，修复损伤部位，形成修复性牙本质〔3〕。牙髓细胞由成纤维细胞、分化程度不等的祖细胞等组成。牙髓细胞分化形成成牙本质细胞的过程不是由某一种细胞分化形成，而是由不同分化能力的祖细胞群共同形成的〔4〕。既往研究表明，可通过构建体外诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化模型，研究牙髓细胞分化机制，为牙齿修复性研究提供更多的理论依据〔5〕。Runt相关转录因子(Runx)2在成骨细胞和成牙本质细胞分化、成熟过程中起关键性作用。研究表明，Runx2通过调控成骨和成牙本质细胞分化的相关基因的表达，参与成骨和成牙本质细胞的分化过程〔6〕。本实验拟研究过表达Runx2基因对成牙本质细胞分化相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料与设备 高糖型DMEM培养基、胎牛血清，购自美国GIBCO公司，碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，TRIzol试剂、反转录试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，Runx2抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗均购自美国CST公司，酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，实时定量PCR仪购自美国AB公司，凝胶成像系统购自德国Royal Intas Gel Hood Imager公司。

1.2细胞培养及成牙分化诱导 收集12～15岁因正畸而拔除的健康前磨牙，收集前均已征得患者及家属的同意。采用无菌眼科镊取出完整的牙髓组织，经酶消化后，置于原代细胞培养基中，在5% CO2、37℃培养箱中培养，每隔3 d更换1次培养基，使用2.5%胰酶消化贴壁细胞进行传代，第4代细胞用于后续实验。

取第4代牙髓细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到约90%时，培养基更换为矿化诱导培养基(每100 ml诱导培养基含有1 μmol β-磷酸甘油钠、10-6μmol地塞米松和5 mg抗坏血酸)，37℃培养箱中培养，收集0、7、14 d的各组细胞用于后续实验。

1.3测定ALP的活性 提取0、7、14 d细胞中的总蛋白，取15 μl蛋白样品、100 μl混合液加入96孔板中，轻轻振荡混匀，37℃水浴锅中反应15 min，每孔加入150 μl显色剂，置于酶标仪上测定各孔在520 nm波长的吸光值(OD520 nm)，计算各组ALP的活性。实验重复3次，每孔4个复孔。

1.4细胞转染 收集牙髓细胞，按2×104个/孔接种到6孔板上，在37℃培养箱中孵育24 h，根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行操作，将细胞随机分为2组，阴性对照组中加入pcDNA3.1空载质粒，pcDNA3.1-Runx2组中加入pcDNA3.1-Runx2质粒，转染后置于培养箱中继续培养48 h，将培养基更换为矿化诱导液，细胞培养箱中培养7 d和14 d进行后续实验。

1.5蛋白质免疫印迹法(Western印迹)检测转染后细胞中Runx2蛋白的表达量 收集转染细胞，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入200 μl细胞蛋白裂解液，置于冰上裂解15 min，提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，95℃加热5 min。配置10%的分离胶和5%的浓缩胶，加入电泳液。55 V电泳40 min，调整电压至120 V继续电泳90 min。将所得蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中封闭1 h，加入适量浓度的一抗，4℃孵育过夜，TBS/T漂洗3次×10 min，加入HRP标记的二抗，37℃孵育1 h，TBS/T漂洗3次×10 min，避光加入电光化学发光法(ECL)反应液，曝光，显影、定影，凝胶成像系统分析蛋白水平。

1.6实时定量PCR(qRT-PCR)检测牙髓细胞中分化相关基因的表达 利用Primer 5.0软件设计牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)基因的引物序列，DSPP上游序列为5′-CCATTCCCACGGACTCCCA-3′，下游序列为5′-TGGCGATGCAGGTCACAAT-3′；BSP游序列为5′-CAAGCATGCCTACTTTTATCCTC-3′，下游序列为5′-CTTCTTGGGAAGCTGGATTG-3′。转染细胞经矿化诱导液培养后，加入1 ml TRIzol细胞裂解液提取细胞中的总RNA，去除基因组DNA，采用反转录试剂盒合成cDNA，GAPDH为参照，进行扩增。扩增条件为预变性94℃ 10 min，94℃ 10 s，58℃/60℃ 15 s，72℃ 30 s，40个循环。使用2-ΔΔCt方法计算DSPP、BSP mRNA表达水平，实验重复3次。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两样本差异使用LSD-t检验。

2 结 果

2.1牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中ALP活性的变化 牙髓细胞经矿化诱导，与0 d〔(1.456±0.068)U/g〕相比，在分化诱导的第7和14天，细胞中ALP的活性显著升高〔(10.659±1.526)U/g,(21.863±3.568)U/g〕(P<0.05)，且ALP的活性在分化诱导的第14天较第7天显著升高(P<0.05)，表明牙髓细胞向成牙本质细胞分化模型构建成功。

2.2转染过表达载体对细胞中Runx2蛋白表达量的影响 牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中，Runx2的表达量逐渐增加；与阴性对照组相比，在分化诱导的第7和14天，pcDNA3.1-Runx2组细胞中Runx2的含量显著升高(P<0.05)。见表1、图1。

表1 转染过表达载体对细胞中Runx2蛋白表达量的影响

与阴性对照组相比：1)P<0.05；下表同

1：阴性对照组；2：pcDNA3.1-Runx2组图1 转染过表达载体对细胞中Runx2蛋白表达量的影响

2.3Runx2过表达对牙髓细胞分化相关基因水平的影响 牙髓细胞转染后，细胞中DSPP mRNA和BSP mRNA在0 d差异不显著，在分化诱导的第7和14天，细胞中DSPP mRNA(P<0.05)和BSP mRNA(P<0.05)水平均显著高于阴性对照组。见表2，表3。

表2 Runx2过表达对牙髓细胞中DSPP mRNA表达的影响

表3 Runx2过表达对牙髓细胞中BSP mRNA表达的影响

3 讨 论

牙髓组织可形成牙本质，对牙齿的修复、营养、防御具有重要作用。牙髓组织主要由牙髓细胞组成，参与牙齿损伤修复过程。牙髓细胞是一种混合型细胞，在成牙分化过程中起主要作用的是祖细胞群。研究证实，体外诱导成牙分化过程与体内成牙本质细胞的分化过程极为相似，因此可通过体外构建牙髓细胞向成牙本质细胞分化模型，研究成牙分化的相关机制〔5〕。ALP是反映牙齿矿化的关键性酶，对牙髓细胞的分化过程起重要作用〔7〕。在牙髓细胞分化为成牙本质细胞的过程中，ALP的活性逐渐增强〔8〕。研究表明，ALP是重要的早期成牙本质细胞分化的相关标志〔9〕。在本实验中，ALP在牙髓细胞诱导的过程中活性逐渐升高，与前人研究结果一致，说明体外诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化模型构建成功。

Runx2是Runt基因家族的重要成员之一，在成牙分化和成骨细胞增殖过程中发挥重要作用。研究报道显示，在成牙本质细胞分化过程中，Runx2的表达量逐渐增加，说明Runx2参与成牙分化的形成过程〔10〕。目前，Runx2在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用的相关报道较少。DSPP是一种牙齿发育过程中起关键作用的机制蛋白〔11〕。研究表明，DSPP可作为成牙本质细胞分化过程的重要指标，其表达量一定程度反映牙髓细胞分化能力〔12〕。有文献报道，Runx2能够通过促进DSPP基因的表达，从而促进牙髓细胞向成牙分化的过程〔13，14〕。BSP是细胞外基质中的磷酸化硫化性糖蛋白，在成骨细胞分化、牙髓细胞矿化过程中发挥关键作用〔15-16〕。BSP被认为是成牙本质细胞分化过程的标志基因〔17〕。本实验结果表明Runx2参与调控牙髓细胞向成牙本质细胞的分化过程。过表达载体进一步增加Runx2的表达量。过表达Runx2基因可增加DSPP、BSP的表达，提示Runx2的表达量增加促进牙髓细胞向成牙本质细胞的分化。

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