耿 威 仉慧颖 李 林 陈 岩 邱一凡
(大庆油田总医院消化内科,黑龙江 大庆 163001)
槲皮素是一种广泛分布在水果、蔬菜及常见中草药之中的天然黄酮类化合物〔1〕,可抑制膀胱癌、卵巢癌、结肠癌等多种恶性癌细胞增殖〔2~4〕,及肝癌、宫颈癌、乳腺癌等癌细胞的恶性侵袭〔5~7〕,其作为一种天然的抗肿瘤药物,已得到广泛的认可〔8〕。Caveolin(Cav)-1是一种位于人染色体7q31.2,编码22 kD的小凹蛋白,是细胞膜表面小凹结构的主要成分,在癌症治疗中充当着肿瘤抑制因子的角色〔9〕。本文主要研究槲皮素对胃癌细胞增殖和侵袭的影响并探讨其可能的分子机制。
1.1一般资料 槲皮素购置于美国Sigma 生物公司,用二甲基亚砜(DMSO)配成储液,-20℃冰箱保存。RPMI-1640培养液来自美国Thermo 公司,胃癌细胞株(SGC-7901)来自上海生命科学院生物化学和细胞研究所;新生小牛血清来自杭州四季青生物公司,噻唑蓝(MTT)试剂为上海碧云天生物公司产品,Transwell小室为美国康宁公司产品。全自动Western印迹实验系统,购于美国 Bio-Rad 公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒购自Pierce公司,基底膜胶(Matrigel)购自BD公司,Cav-1 单克隆抗体购于Bioworld 公司。β-actin 鼠源性单克隆抗体购自 Sigma公司。
1.2细胞培养 将SGC-7901细胞置于37℃、5% CO2培养箱中贴壁培养,培养在RPMI-1640培养液(含10%新生牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml)中。待细胞至对数生长期后收集,调整细胞浓度为1×104个/ml,按每孔100 μl接种到96孔板中培养24 h。
1.3细胞增殖实验 采用MTT比色法。将上述培养的细胞随机分为5组,分别加入终浓度为20、40、60、80及100 μmol/ml的槲皮素,每组设置3个复孔,以不含槲皮素的细胞作为对照组,以空白孔调零,分别培养24、48、72 h,每孔加入MTT 100 μl作用4 h,加入DMSO 100 μl孵育30 min,在酶标仪570 nm处测吸光度A值,按公式计算细胞增殖抑制率:抑制率(%)=〔( A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)〕×100%。
1.4细胞侵袭实验 采用Transwell小室法。分别用不含血清的 RPMI-1640培养基重悬实验组及对照组细胞,制备单细胞悬液。将单细胞悬浮液调制浓度为约2×105个/ml,将各处理组细胞用胰酶消化并接种于25 μl Matrigel包被的Transwell小室中。上室加200 μl细胞悬液,下室加500 μl含10%血清的培养基作为趋化因子,培养24 h后取出小室,4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,荧光显微镜下观察并记录,每孔随机选取10个200倍视野,计数侵袭细胞数。
1.5Western印迹法检测Cav-1蛋白的表达情况 将培养了24 h后的细胞分成3组,提取每组的蛋白样品,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,并在含8%的脱脂牛奶的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(TBS)-吐温(T)中室温封闭2~4 h。孵育一抗,自封袋封闭4℃过夜,室温下用TBS-T摇床洗膜:15 min ×1次和5 min×3次。孵育二抗,室温下封闭1~2 h,室温下用TBS-T摇床洗膜15 min ×1次和5 min×4次。加入化学发光液、显影、定影,并保存胶片。将胶片进行扫描,用IPP6.0软件测定印迹区带的光密度值。以β-actin 为内参照,分析数据。蛋白表达强度=样品中目的蛋白光密度值/相应β-actin 的光密度值。
1.6统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。
2.1槲皮素对胃癌细胞增殖能力的影响 随着药物浓度的递增,24 h时,槲皮素对 SGC-7901的IC50为70.3 μmol/L;48 h时,IC50为41.6 μmol/L;72 h时,IC50为30.2 μmol/L。随着槲皮素浓度的增加,其对胃癌细胞SGC-7901的抑制显著增强(P<0.05),且抑制能力随时间的增加而显著增大(P<0.05)。见表1。
表1 槲皮素作用 24、48、72 h对SGC-7901 的增殖抑制率
与同时间对照组比较:1)P<0.05;与同浓度24 h比较:2)P<0.05;与同浓度48 h比较:3)P<0.05;与同时间前一浓度比较:4)P<0.05
2.2槲皮素对胃癌细胞侵袭能力及Cav-1蛋白表达的影响 槲皮素各浓度组胃癌细胞侵袭数量与对照组比较明显减少(P<0.05),并且随着槲皮素浓度的增大,胃癌细胞侵袭的细胞数量越来越少(P<0.05)。24 h后,槲皮素各浓度组Cav-1蛋白表达明显低于对照组,且槲皮素的浓度越高,Cav-1 蛋白表达显著降低。见表2,图1。
表2 槲皮素对胃癌细胞侵袭数量及Cav-1蛋白表达的影响
与对照组比较:1)P<0.05;与前一浓度比较:2)P<0.05
图1 各组Cav-1 蛋白表达情况
胃癌细胞的增殖、浸润和转移是大多数胃癌患者的死亡原因。抗肿瘤药物槲皮素对胃癌的研究主要集中在对胃癌细胞增殖及机制的探讨〔10,11〕,对胃癌细胞生长及凋亡的研究〔8,12,13〕,但是对胃癌细胞侵袭的研究较少〔14〕。本研究发现,胃癌细胞的增殖、侵袭能力和Cav-1的表达情况均与槲皮素的浓度呈现依赖性。
Cav-1为支架蛋白,直接作用于受体、激酶、黏附分子和 G-蛋白等信号分子,并可以控制亚细胞的分布和激活状态。参与了小泡运输、胆固醇动态平衡、大分子的内吞和调节信号转导通路及细胞内钙浓度等许多重要的细胞活动过程,Cav-1蛋白链N端的脚手架区域可通过识别特定的序列,与多种信号分子结合并调节其活性,如受体酪氨酸激酶等,影响多种信号转导过程,进而参与了细胞的恶性转化、增殖、侵袭等众多恶性生物学行为。研究发现Cav-1的表达在不同肿瘤,同一肿瘤不同亚型或同一肿瘤发展的不同阶段均是不同的〔9,15〕。
综上,槲皮素可抑制胃癌细胞增殖和侵袭,其机制可能与Cav-1 蛋白的表达有关,然而,也有研究发现胃癌细胞的增殖与抑制端粒酶活性有关〔16〕,胃癌细胞侵袭与下调基质金属蛋白酶(MMP)-2基因表达有关〔14〕,胃癌组织中Cav-1的低表达可能促进了胃癌的侵袭〔17〕。所以,槲皮素对胃癌细胞影响的具体内在作用机制值得深入研究。
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