CD4+CD25+Treg细胞比例与老年动脉粥样硬化性脑梗死的相关性

毛可适 王正阁 任艳玲 蒋 颖 刘 猛

(苏州大学附属第三医院 常州市第一人民医院神经内科，江苏 常州 213000)

动脉粥样硬化(AS)是一个长期的免疫炎性反应过程，免疫调节性T细胞在其发生发展进程中扮演重要角色〔1，2〕。CD4+CD25+Treg细胞是一种新型免疫调节性T细胞，具有一定抗AS的作用，但目前尚无其在脑梗死急性期动态变化及与AS程度相关性的研究〔3〕。本研究旨在分析CD4+CD25+Treg细胞比例的动态演变过程及其与AS程度的相关性。

1 资料和方法

1.1研究对象 经常州市医学伦理委员会同意，选取常州市第一人民医院2014年1月至2016年1月收治的老年AS性脑梗死患者48例作为观察组。纳入标准：(1)年龄≥65岁且<80岁，男女不限；(2)符合全国第四届脑血管病学术会议修订的急性脑梗死的诊断标准，经病史和影像学检查证实〔4〕；(3)颈部血管彩超检测颈动脉内-中膜厚度(IMT)>1.0 mm；(4)于发病当天入院。排除标准：(1)近3个月内发生急性心脑血管疾病者；(2)近3个月服用过非甾体类抗炎药、免疫抑制剂、类固醇等可影响外周血CD4+CD25+Treg细胞水平的药物；(3)近1个月内发生感染性疾病者；(4)合并糖尿病、代谢性疾病和重要器官功能不全者；(5)合并神经精神类疾病者。将观察组根据颈动脉硬化程度〔5〕分为轻度组(1.0 mm0.05)，具有可比性。见表1。所有研究对象对本次研究知情并签署同意书。

1.2实验试剂及仪器 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人IgG和CD25抗体，PE标记的鼠抗人CD4抗体(美国Beckman Coulter公司)；(2)磷酸盐缓冲液(PBS)(北京利得曼生物科技有限公司)；(3)DT5-2型离心机(北京时代北利离心机有限公司)；(4)Epics XL型流式细胞仪、流式试管及配套设备(上海珂淮仪器有限公司)；(5)飞利浦CX50彩色多普勒超声诊断仪(上海创讯医疗器械有限公司)。

表1 各组一般资料对比

1.3方法

1.3.1CD4+CD25+Treg细胞比例检测 采取研究对象清晨空腹静脉血2 ml于抗凝真空管中，置于-80℃冰箱中保存待测。取2支FCM试管，各加入150 μl抗凝血，避免枪头触碰管底及管壁，动作迅速，不要将血挂在管壁上，操作完毕后振荡混匀，分别标记为对照管和染色管。于对照管中滴加IgG-FITC和CD4-PE各10 μl，染色管中滴加CD25-FITC和CD4-PE各10 μl，振荡摇匀后避光室温条件下放置20 min。然后在2支试管中滴加红细胞裂解液400 μl和PBS液400 μl，振荡摇匀后避光5℃放置20 min，2 000 r/min离心10 min，弃上清液后再次滴加PBS液500 μl重悬制备单细胞悬液。将单细胞悬液置于流式细胞仪中检测，每个样品检测30 000个以上细胞，通过软件分析并计算CD4+CD25+Treg细胞百分比。

1.3.2IMT测量 采用配置7.0～10.5 MHz线阵探头的飞利浦CX50彩色多普勒超声诊断仪对受试者双侧颈动脉进行检查：患者平卧位，头稍后仰，充分暴露检查部位，将探头置于颈前，自颈动脉起始处扫描，多平面、多角度依次检查颈总动脉、颈总动脉分叉处及颈内动脉。注意观察血管管壁、管径和斑块情况。在纵向探查血管壁时可见较亮的两条平行线，两线间垂直距离为IMT，以双侧颈总动脉远端近分叉处1 cm、分叉处和颈内动脉起始处上方1 cm共3个部位的IMT平均值作为结果〔6〕。

1.4观察指标 (1)发病后1～7 d观察组、对照组及各亚组CD4+CD25+Treg细胞百分比；(2)观察组IMT与CD4+CD25+Treg细胞百分比的相关性。

1.5统计学方法 应用SPSS18.0软件，计量资料多组间比较采用方差分析，两两比较应用t检验，计数资料应用χ2检验。

2 结 果

2.1观察组脑梗死后不同时间外周血CD4+CD25+Treg细胞水平变化 脑梗死后第1天和第2天观察组CD4+CD25+Treg细胞百分比均低于对照组，第5～7天高于对照组(P<0.05)，其余2 d差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2脑梗死各亚组发病不同时间外周血CD4+CD25+Treg细胞水平变化 脑梗死后第1～7天，三亚组间CD4+CD25+Treg细胞百分比比较差异均有统计学意义(P<0.05)，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 观察组发病后1～7 d外周血CD4+CD25+Treg细胞水平变化

表3 脑梗死各亚组发病不同时间外周血CD4+CD25+Treg细胞水平变化

与轻度组比较:1)P<0.05；与中度组比较:2)P<0.05

2.3外周血CD4+CD25+Treg细胞水平与IMT的相关性 外周血CD4+CD25+Treg细胞水平与颈动脉IMT值具有一定相关性，以发病后第4天为例，观察组CD4+CD25+Treg细胞百分比与颈动脉IMT值呈明显负相关(r=-0.543,P<0.05)。见图1。

图1 脑梗死患者外周血CD4+CD25+Treg细胞水平与颈动脉IMT值的相关性

3 讨 论

急性脑梗死的病理基础为AS斑块破裂和血栓形成，免疫反应和炎性反应伴随在整个发生发展过程中，对其损伤机制的深入研究可为诊断和治疗AS性脑梗死提供重要指导意义〔7，8〕。CD4+CD25+Treg细胞是一种由Th1细胞分化而来的免疫调控细胞，可通过分泌炎性因子调控促炎/抗炎平衡，研究机体CD4+CD25+Treg细胞比例可为监测患者病情动态变化、制定针对免疫功能的治疗方案提供新思路〔9〕。

从本次研究的结果来看，急性脑梗死后CD4+CD25+Treg水平是一个先下降后升高的过程。结合Knoflach等〔10〕的研究，分析可能与局部炎症反应同全身免疫反应间平衡有关，脑梗死后早期炎症反应以局部促炎反应为主，辅助性T(Th)细胞、树突细胞和单核巨噬细胞等致病性细胞，肿瘤坏死因子(TNF)-α、趋化性细胞因子等炎性介质大量表达，通过破损的血脑屏障进入炎性区域与固有炎性反应共同发挥作用，因此CD4+CD25+Treg细胞百分比低于对照组。随着时间推移，上述细胞及细胞因子刺激机体分化CD4+CD25+Treg细胞，目的在于表达Foxp3、转化生长因子(TGF)-β和白细胞介素(IL)-10等细胞因子，从而抑制促炎因子表达，通过调节免疫平衡减轻梗死部位脑组织的免疫损伤，因此CD4+CD25+Treg细胞百分比高于对照组〔11〕。本研究与胡月华等〔12〕的结果一致，说明CD4+CD25+Treg细胞百分比可作为评估AS程度的一个客观指标，其机制可能与以下两点有关：(1)生成减少，AS往往伴随低密度脂蛋白(LDL)的生成和血管内皮细胞的破坏，在单核细胞浸润的环境下，CD4+T细胞更易分化为Th1细胞，旨在通过分泌TNF-β、IL-2和IL-4等致炎因子，导致CD4+CD25+Treg细胞的比例下降；此外，机体异常激活状态也可直接抑制CD4+T细胞向CD4+CD25+Treg细胞分化。(2)自身凋亡，AS的进展也是氧化应激的过程，氧化应激状态可直接促进细胞凋亡，与其他CD4+T细胞相比，CD4+CD25+Treg细胞对氧化应激具有更高的敏感性，因此比例大大降低。综上，老年AS性脑梗死患者急性期外周血CD4+CD25+Treg细胞百分比可作为评估脑缺血及血管内皮功能的非侵入性指标，对指导治疗具有重要意义。

1冯 静，费 瑜，孟晓萍.CD4+和CD8+T淋巴细胞与动脉粥样硬化相关性研究进展〔J〕.中国动脉硬化杂志，2011;19(8)：707-10.

2张津华，马丽丽，李江坤，等.不同TOAST分型脑梗死患者外周血T淋巴细胞亚群的分布特点〔J〕.广东医学，2014;35(20)：3178-80.

3刘晓阳，康春阳，韩莹莹，等.急性动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)水平的变化及临床意义〔J〕.中国实验诊断学，2013;17(9)：1621-4.

4Mandavia R,Qureshi MI,Dharmarajah B,etal.Safety of carotid intervention following thrombolysis in acute ischaemic stroke〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg,2014;48(5):505-12.

5金夕雅，王立波，赵云华，等.急性动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的动态变化研究〔J〕.中国实验诊断学，2013;17(8)：1423-5.

6王润芳，梁红萍.急性脑梗死患者T淋巴细胞亚群的变化及意义〔J〕.山西中医学院学报，2013;14(5)：73-4.

7蒋福生，张 平，张新华.急性脑梗死患者免疫调节性T淋巴细胞表达与预后的关系〔J〕.中国动脉硬化杂志，2013;21(10)：923-6.

8聂大奥，陈俊抛，邢一兰.急性脑梗死患者外周血CD4CD25T细胞和CD4CD28-T细胞的变化〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2014;16(3)：230-2.

9张 倩，孙 薇，杨建波，等.颈动脉粥样硬化性急性脑梗死患者辅助性T细胞17和调节性T细胞的表达水平及意义〔J〕.临床荟萃，2015;30(6)：682-3.

10Knoflach M,Matosevic B,Rucker M,etal.Functional recovery after ischemic stroke—A matter of age〔J〕.Neurology,2012;78(4):279-85.

11Xie P,Su Y,Tang H,etal.The effect of CD4+CD25+regulatory T cells on the proliferation,migration and adhesion of endothelial progenitor cells〔J〕.J Clin Cardiol(China),2011;27(1):63-6.

12胡月华，郑燕华，唐 隽，等.颅内动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞检测及意义〔J〕.免疫学杂志，2011;27(5)：420-3.