马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344发酵产物的分离鉴定与活性分析

余 成，刘 宁，张志敏，黄 英，岳昌武*

（1.遵义医学院第三附属医院中心实验室 遵义医学院贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州 遵义 563003；2.中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100020；3.遵义医学院 医学遗传学教研室，贵州 遵义 563003）

迄今为止，已知得到实际应用的微生物活性物质中超过一半成来自放线菌[1]，而目前从放线菌中发现的次级代谢产物数量不足其实际存在的10%[2]。因此，对放线菌产生的次级代谢产物进行挖掘是发现创新药物的重要途径。由于生境（如海拔、纬度、湿度等）均对放线菌的生长代谢甚至进化都有巨大的影响[11]，所以在特殊生境下分离得到的特殊放线菌，从中获得新的生物活性物质的可能性也更高[3]。

马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）是一种稀有放线菌，可产生四大家族的有高抗肿瘤活性的抗生素，分别为veractamycins、FR-900405同类物、esperamicins及barminomycins[4]。甄永苏等[5]对一株马杜拉放线菌进行了研究并发现了其发酵产物洋红霉素（carminomycin），其作为抗肿癌化疗药物曾应用于临床多年[6]。而与之结构近似的蒽环类抗生素柔红霉素（daunorubicin）仍是临床一线化疗药物，其在市场上供不应求，国内外一直在对采用生物发酵法制备柔红霉素的技术进行研究[7-8]。

江西红壤为一种富含铁、铝的酸性土壤，由于其特殊的生境条件，其中生长着许多特殊的放线菌[9]。本课题组从江西武山的红壤中分离得到了一株马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344。采用改良培养基，对这株马杜拉放线菌发酵培养后，将代谢产物分离纯化，并采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）制备化合物纯品，通过对其进行核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析和超高效液相色谱-串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）仪检测，并将数据与相关文献比对，鉴定菌株的次级代谢产物的结构。对纯化物的抗菌活性和最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）检测，以期为抗生素开发提供潜在的先导化合物。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 测试菌株

马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344：分离自江西武山取样点10～20 cm深的酸性红壤；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）：潍坊医学院；多重耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）：北京307医院[16]；藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、绿色木霉菌（Trichoderma viride）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

发酵培养基：土豆淀粉10 g，葡萄糖10 g，甘油10 g，玉米浆2.5 g，蛋白胨5 g，酵母提取物2 g，人工海盐1 g，碳酸钙3 g，加双蒸水定容至1 L。

菌株活化培养基采用葡萄糖酵母提取物麦芽提取物（glucose yeast extract malt extract，GYM）固体培养基：葡萄糖4 g，碳酸钙2 g，麦芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，琼脂粉18 g，加双蒸水定容至1 L。

细菌采用LB营养琼脂、LB肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限公司；真菌采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，双蒸水1 L。

1.1.3 化学试剂

乙醇、甲醇、氯仿、甲醇、乙腈（均为分析纯）：北京化工厂；甲醇、乙腈、甲酸等（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

硅胶60薄层层析铝箔板：德国默克公司；柱层层析硅胶（200～300目）：青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱：美国GEHealthcare公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌锅：日本三洋株式会社；SPX-250B-Z培养箱：上海博讯实业有限公司；Himac CF15RX高速离心机：日本日立公司；ZQZY-CF振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津有限公司；G2-QTof超高效液相色谱四级杆飞行质谱联用仪：美国沃特世有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株发酵及产物粗提

种子培养：采用划线法将菌种活化接种于90 mm规格GYM固体培养基平皿中，28℃恒温培养4～5 d使得气生菌丝和孢子丝发育完善[15]。将活化菌株接种至发酵用改良VER培养基的固体培养基平皿，28℃静置培养5 d，以获得马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的种子菌。将培养皿的带菌琼脂块切割为1 cm×1 cm厚度为0.5 cm大小的种子块。

发酵培养：使用30个500 mL锥形瓶（每瓶含有100 mL改良VER液体培养基，共计3 L）进行液体发酵，每瓶接种约0.5 cm3GYM固体含菌琼脂块，28℃条件下160 r/min振荡培养8 d后取出。

发酵产物粗提：将培养完成后的发酵液在8 000 r/min条件下离心10min分离上清液和菌丝体。将菌丝体收集后，使用等体积无水乙醇振荡抽提3次，每次抽提约8 h；合并乙醇抽提液后减压浓缩并用少量甲醇溶解，减压浓缩得菌丝体粗提物（约12 g）。

1.3.2 粗提物的HPLC分析检测

取菌丝体粗提物50μg，溶解于400μL的甲醇中，离心取上清，取20μL进行HPLC分析其组成成分，从中选择响应值高且分离度较好的峰，作为目标化合物。其色谱条件为：Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱温28℃；流速1.0 mL/min；甲醇与水梯度洗脱（起始为20%甲醇+80%水；0～15 min甲醇体积分数由20%梯度递增至100%；15～20 min保持100%甲醇；20 min至26.5 min维持20%甲醇+80%水不变）。

1.3.3 粗提物的硅胶柱层析

用硅胶柱层析法对粗提物进行分离[13]。采用干法上样，流动相条件使用氯仿甲醇梯度洗脱，以氯仿∶甲醇（95∶5，V/V）比例起始，每100 mL流动相增加5%的甲醇比例，递增至60∶40（V/V）截止。接柱时以每10 mL为一个流分，共收集90个流分。

用薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）将流分分段。在薄层层析硅胶板上对90个流分的偶数号样品点样分析，在紫外灯下观察其荧光[18]。其荧光相同的样品点判定为含有相同组分，将相同组分的样品合并。HPLC对合并后的样品段进行检测，观察各分段的组分情况，选择目标产物较多、样品量较多、组分相对简单且包含所有目标峰的分段，作为后续纯化的样品。

1.3.4 粗提物的凝胶柱层析

用LH-20葡聚糖凝胶柱对菌丝体粗提物硅胶层析柱各个浓缩后的合并流分进行分子筛：流分浓缩并湿法上样后采用甲醇∶氯仿1∶1（V/V）混合溶剂作为流动相，等度洗脱，按照每管3 mL收集洗脱液，用1.3.3中的方法，用TLC检测合并分段，用HPLC检测选择下一步的样品段。

1.3.5 目的产物的HPLC制备与鉴定

将LH-20葡聚糖凝胶柱分离后得到的样品段进行HPLC制备，其色谱条件为：Waters XBridge C18色谱柱（5μm，4.6 mm×150 mm），柱温维持28 ℃；甲醇∶水88∶12（V/V）等度洗脱。采用超高效液相色谱-串联质谱和核磁对得到的目标化合物进行结构鉴定。

1.3.6 化合物的抗菌活性测试

配制质量浓度为50μg/mL目标化合物的甲醇溶液，采用滤纸片法对目标化合物进行抗菌活性测试[14]。测试菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、鲍曼不动杆菌、绿色木霉菌、尖孢镰刀菌。具体测试方法如下：细菌采用LB固体平皿37℃过夜培养，以质量浓度为50μg/mL目标化合物的甲醇溶液为实验组，以100 mg/mL的广谱抗菌药物安普霉素的甲醇溶液为阳性对照，以纯甲醇为阴性对照，在每片滤纸片（直径为6 mm）上滴加10μL样品，贴在涂布有1 mL约（106～107）个/mL浓度测试菌菌悬液的固体培养基平皿上培养，细菌采用LB培养基37℃培养8～12 h；真菌采用PDA培养基25℃培养24～48 h，后观察抑菌圈直径[11]。

采用对倍稀释法[12]测试目标化合物的最小抑菌浓度（MIC）。将目标化合物与安普霉素分别配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液。将藤黄微球菌于LB液体培养基中，培养至透光率为40%后稀释1 000倍待用。用LB液体培养基进行梯度稀释，配制成浓度为105个/mL的菌悬液。在96孔板中加入100μL LB培养基作为空白对照，加入100μL上述105个/mL不加药测试菌液作为阴性对照，并采用安普霉素作为阳性对照药。化合物用LB液体培养基对倍稀释成各所需浓度，分别与90μL菌悬液混匀加入96孔板，体系终体积为100μL。生长6～8 h后无菌生长的孔板内所含化合物最低浓度，即为该目标化合物对耐药藤黄微球菌的MIC。

2 结果与分析

2.1 放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的菌丝体粗提物的制备与检测

将放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的菌丝体用无水乙醇提取，得到粗提物用HPLC检测，结果见图1。由图1可知，菌丝体粗提物中成分相对简单，选择保留时间14.5min出为目标峰A，保留时间18.5 min处为目标峰B，保留时间19.3 min处为目标峰C。

图1 菌株FXJ1.344菌丝体粗提物的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mycelium crude extract of strain FXJ1.344

2.2 菌丝体粗提物分离与分段

菌丝体粗品用硅胶柱层析粗分后得到90个流分，偶数号样品点板用TLC分析，部分结果见图2。由图2可知，26号至52号的薄层层析在两种波长紫外线照射下的荧光，32号样与34号样品组分不同，44号与46号样品不同。故将32号后至46号前（均不含）的合并为33～45段。

图2 菌丝体粗提物部分分段在365 nm(A)和254 nm(B)的TLC荧光图Fig.2 TLC fluorogram of part of mycelium crude extract in 365 nm(A)and 254 nm(B)

图3 硅胶柱层析后1～13段(A)、14～32段(B)、33～45段(C)及46～90(D)段的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of 1-13(A),14-32(B),33-45(C)and 46-90(D)segments after silica gel column chromatography

采用类似分析方法，将90个流分分为四大段：1～13、14～32、33～45、46～90段。将分段合并后用HPLC检测，结果见图3。由图3可知，第一段组分极少，第二段缺少目标峰B，第三段中目标峰A处杂峰很多不利于后期分离，第四段组分得到了较好的分离，目标峰齐全且样品量大。故选择第四段作为后续纯化的样品。

2.3 菌丝体粗提物高效液相色谱法制备

将46～90段的浓缩液为样品，用葡聚糖凝胶柱层析法得到47个流分，经TLC和HPLC检测分段，选取16～28段样品为HPLC的制备样品。将样品段浓缩处理，用甲醇水等度洗脱制备各化合物，结果见图4。由图4可知，制备得到保留时间（retention time，TR）分别为TRA=2.00 min、TRB=6.20 min、TRC=8.10 min化合物A（4.0 mg）、B（3.0 mg）和C（2.0 mg），经过核磁检测发现化合物A为混合物，化合物B和C是纯化物。

2.4 结构鉴定

采用超高效液相色谱串联质谱法对化合物B的结构进行鉴定：深绿色针状晶体，m/z321.0764[M+H]+，分子式：C19H12O5，计算不饱和度为14；UV λmax：224 nm、316 nm、454 nm（in MeOH）：1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：2.38（3H，s，3-Me），6.88（1H，d，J=1.0 Hz，2-H），7.02（1H，s，4-H），7.27（1H，d，J=8.5 Hz，9-H），7.59（1H，s，5-H），7.65（1H，dd，J=8.0，7.0 Hz，10-H），7.78（1H，d，J=7.5，Hz，11-H），10.24（1H，s，1-OH），11.70（1H，s，8-OH），12.05（1H，s，6-OH）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：21.4（C3-Me），114.7（C-7a），118.3（C3），118.5（C2），119.7（C-4），119.7（C-6a），121.6（C-11），124.0（C-5），125.1（C-9），132.8（C-12a），135.0（C-11a），137.7（C-10），141.5（C-12b），142.8（C-4a），154.3（C-1），156.6（C-6），161.9（C-8），189.2（C-12），193.2（C-7）；根据天然产物数据库检索，以上数据与化合物6-hydroxytetrangulol[10]保持一致，推定化合物B为6-hydroxytetrangulol。

图4 凝胶柱层析后菌丝体粗提物样品HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of mycelium crude extract sample after gel column chromatography

采用超高效液相色谱串联质谱法化合物C的结构鉴定：红褐色针状晶体，m/z305.0814[M+H]+，分子式：C19H12O4，计算不饱和度为14；UVλmax：223 nm、314 nm、428 nm（in MeOH）：1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：2.51（3H，s，3-Me），7.17（1H，s，2-H），7.28（1H，s，4-H），7.34（1H，d，J=8.5 Hz，9-H），7.70（1H，dd，J=8.5，7.5 Hz，10-H），7.87（1H，d，J=7.5 Hz，11-H），8.16（1H，d，J=9.0，6-H），8.34（1H，d，J=8.5，5-H），11.27（1H，s，1-OH），12.26（1H，s，8-OH）；13C-NMR（CDCl3，125MHz）：21.3（C3-Me），114.7（C-7a），120.0（C3），120.2（C2），121.3（C-4），121.3（C-6），121.29C-6a），121.9（C-11），124.8（C-9），132.4（C-12a0，134.89C-11a），136.9（C-5），137.79C-10），139.1（C-4a），142.0（C-12b），155.3（C-1），161.7（C-8），187.9（C-7），189.7（C-12）；根据天然产物数据库检索，以上数据与化合物tetrangulol[10]保持一致，推定化合物C为tetrangulol。化合物B、C的结构式如下：

6-hydroxytetrangulol（B）：R=OH，tetrangulol（C）：R=H

2.5 纯化物B、C的抗菌活性测定

采用滤纸片法对化合物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol进行活性测试，以甲醇为阴性对照，抗菌活性测定结果见图5。

图5 化合物B(6-hydroxytetrangulol)和化合物C(tetrangulol)对耐药藤黄的滤纸片法抑菌活性测试Fig.5 Antibacterial activity tests of compound B(6-hydroxytetrangulol)and compound C(tetrangulol)by filter paper method

由图5可知，纯化物B、C均对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）有较强的抑制活性，抑菌圈直径分别为16 mm和14 mm，而对其他测试菌均无明显活性。

用对倍稀释法检测两个化合物的对这株耐药藤黄微球菌的最低抑菌浓度（MIC），通过肉眼观察和酶标仪检测，得到阳性对照安普霉素对这株菌的MIC为7.81μg/mL，纯化物B（6-hydroxytetrangulol）对这株菌的MIC为3.90 μg/mL，纯化物C（tetrangulol）对这株菌的MIC为15.6 μg/mL。

3 结论

Angucyclinone类抗生素一直受到广泛而持久的关注，此类化合物也在不断地被挖掘发现[17]。尽管化合物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol并非首次发现，但近年来少有国内外的文献对其抗菌活性进行研究，本实验发现其较好的抗藤黄微球菌活性为首次报导。本研究通过分离纯化方法，对江西酸性红壤来源的马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）FXJ1.344的发酵产物进行了纯化和鉴定，在其次级代谢产物中得到了2种angucyclinone类纯化物6-hydroxytetrangulol和tetrangulol。用滤纸片法和对倍稀释法对其抗菌活性做了研究，发现这两个化合物均有较好的抗藤黄微球菌活性，其MIC值显示与安普霉素的抗菌活性相当甚至更佳，有潜在的成药价值。本研究为未来微生物发酵法生产这两种化合物进行了初步探寻，为寻找开发新抗生素提供了先导化合物。

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