美伐他汀降低β-淀粉样蛋白神经毒性的体外研究

黄美媚，黎宏庄，欧阳基鹏，李国兴，黎泳欣，甘育鸿

（1.南方医科大学附属顺德第一人民医院 神经内科，广东 佛山 528300；2.广东医学院 天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）已在全球造成3 500万人患病，主要诊断依据为脑组织尸检的中老年斑沉寂，以及包括神经纤维缠结和脑组织在内的萎缩程度[1]。在以淀粉样蛋白级联的假说中，β-淀粉样蛋白（amyloid β-peptide，Aβ）是造成AD的关键因素[2]。进一步研究指出，一种蛋白质被称为Tau，其形成与AD的发展相关密切[3-4]。相关报道证实，他汀类药物可能也具有治疗AD的效果[5-6]，但其作用机制仍需研究。本研究采用人类神经细胞株体外培养的实验方式，观察美伐他汀是否通过调控神经细胞的方式，达到治疗AD目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人神经上皮瘤细胞（SK-N-MC）（美国ATCC细胞库），人类神经细胞（MC65）（源自SK-N-MC細胞，广东医学院天然药物研究与开发重点实验室制备），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美国Sigma Chemical公司），NaHCO3（上海瀚思化工有限公司），羊抗兔抗体（北京九州天瑞科技有限公司），羊抗、鼠抗体等购自美国Biotium公司，最低基础培养基（minimum essential medium，MEM）、青链霉素双抗溶液、PBS购自北京中国国药，美伐他汀（美国Sigma公司）。

1.2 主要试剂及仪器

薄层层析用硅胶（青岛海洋公司），Western blot检测仪TE22（Holliston，MA）、Thermo 310细胞培养箱购自上海乐陈化工科技公司，涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司），SDS-PAGE电泳槽（美国Thermo Fisher公司），全波长酵素免疫分析仪（美国Bio Pioneer Tech公司），低温离心机（美国Beckman公司），荧光显微镜（日本岛津公司）。

1.3 方法

1.3.1 神经细胞培养选取SK-N-MC、MC65细胞株，用MEM培养液培养。用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的培养基、1%青霉素-链霉素双抗体溶液细胞培养基（100μ/ml和100μg/ml）的培养皿置于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养。当细胞生长至90%，进行抽滤，使用无菌PBS冲洗，在培养皿中加入1 ml 0.05% Trypsin和0.02% EDTA，缓慢摇匀后，将培养皿置于37℃保温箱中，反应1min后将细胞自培养皿表面冲洗下来，1 000 r/min离心5min，取上清液。

1.3.2 MTT法将细胞平均分散至24孔盘中，当细胞生长至50%时，加入0.5 ml/孔 MTT（0.5 mg/ml），将24孔盘置于37℃恒温中30min等待MTT反应。反应结束后，将MTT移除。加入0.5 ml二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO），均匀摇动3min，待细胞内的紫色结晶溶解后，取至96孔盘，用分光光谱仪在波长550 nm处测定吸光值，比较细胞相对存活率。

1.3.3 免疫荧光染色加入BSA，于37℃轻摇30min，分别加入一抗、二抗抗体，各洗涤3次。En VisionTM两步法流程参照文献[7]。

1.3.4 Western blot检测采用12% SDS-PAGE分离50μg总蛋白质，常温下采用醋酸纤维素膜封闭含有3% BSA 的 TTBS[100mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），0.9%NaCl，0.1% Tween 20]。在洗涤1次后，分别2次加入相关抗体，孵育1 h。随后洗涤3次，孵育30min。洗涤3次后，将色源底物孵育5min后显色。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 美伐他汀可以减缓Aβ导致的神经细胞死亡

10μmol/L Aβ作用48 h后，SK-N-MC神经细胞数降低；同时加入20μmol/L美伐他汀，SK-N-MC神经细胞数降低情况改善，表明美伐他汀可以减缓Aβ导致的神经细胞死亡（见图1）。加入10μmol/L Aβ，SK-N-MC神经细胞出现死亡，36 h后细胞活性下降至（20±6）%；同时加入美伐他汀，神经细胞死亡情况改善，36 h后细胞活性下降至（60±15）%，经t检验，差异有统计学意义（t=12.6491，P=0.012）（见图2）。

2.2 美伐他汀神经保护作用与AMPK活化作用的关系

在对照样品中加入10μmol/L Aβ时，AMPK无磷酸化现象。而加入美伐他汀或AMPK的促进剂阿卡地新24 h后，SK-N-MC神经细胞AMPK有明显的磷酸化。AMPK Thr172磷酸化与其活性程度呈正相关，结果显示，美伐他汀可使AMPK进入活化状态。美伐他汀可能通过提高AMPK活性，对抗Aβ毒性，发挥保护神经的作用。见图3。

图1 美伐他汀减缓AD导致的神经细胞死亡 （×50 000）

图2 SK-N-MC神经细胞死亡情况

图3 美伐他汀诱发AMPK Thr172磷酸化

3 讨论

Tau蛋白高度磷酸化是AD的主要病因，Tau蛋白磷酸化由AMPK等一系列激酶调节[3]。多个研究证实，激活AMPK可以抑制Tau蛋白磷酸化，相反抑制AMPK可以增加Tau蛋白磷酸化。研究表明，AMPK是Tau蛋白磷酸化的关键调节因素[8-9]。本实验结果发现，加入美伐他汀后，神经细胞具有明显活化AMPK的能力。此时AMPK的活性对于美伐他汀对抗AD的神经保护效果是必须的。在给予美伐他汀后，AD所导致Tau蛋白过磷酸化现象被的抑制。另有研究显示，AMPK和GSK-3β通过不同通路发挥作用，两者可能存在协同效应[10]。笔者推测，美伐他汀可能通过活化AMPK从而抑制Tau磷酸化，发挥保护神经的作用。

有文献显示，Aβ在AD的发病机制中具有重要作用。因此Aβ对神经细胞毒性的相关研究成为研究重点[11-13]。控制Aβ的生成和清除，从而形成动态平衡，对AD的预防起到重要作用[14]。有研究发现，他汀类药物会造成AMPK活性上升，并进一步改变细胞内能量平衡[15]。

在本实验证明，美伐他汀可以减缓Aβ导致的神经细胞死亡。考虑Tau蛋白沉积，交互聚集成神经原纤维缠结和有毒的可溶性蛋白片段是AD的主要病因。有研究进一步证实，AMPK通过改变Tau蛋白微管结合在Ser396和Ser262位点磷酸化Tau蛋白，并对其进行调控[16-17]。因此AMPK在Tau蛋白磷酸化中挥重要作用。由此笔者推论，美伐他汀可能通过提高AMPK活性，对抗Aβ毒性，发挥保护神经的作用，抑制Tau蛋白磷酸化。

考虑通过抑制Aβ的异常聚集，能阻断AD的发生、发展。因此，无论是从预防，还是治愈的角度考虑，综合应用他汀类药物也是治疗AD的有效方法。

参 考 文 献 :

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