白细胞介素-6对皮质发育障碍大鼠痫性放电的影响

李筹忠 高方友* 孙杰

(1贵州省人民医院神经外科; 2贵航300医院神经外科，贵州 贵阳 550000)

皮质发育障碍(malformations of cortical development, MCD)又被称为皮质发育畸形及皮质发育不良等。是一类神经发育不良疾病的总称，是难治性癫痫和精神发育迟滞的主要病因。根据流行病学调查，局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia, MCD)和结节性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)是最常见的伴发药物难治性癫痫的两类MCD，具有相同的病理学特征，也是研究 MCD 致痫机制常用的疾病模型[1]。引起其致痫的主要原因为MCD病灶中的异构神经元具有典型的过度兴奋性，甚至可自发产生痫样放电活动[2]。皮质发育障碍是难治性癫痫的重要病因之一，目前机制尚不完全明确。

近年一些研究提示，免疫炎症反应在癫痫的发生、发展过程中具有重要作用，细胞免疫和体液免疫均参与其中，相应的抗炎和免疫抑制在一定程度上有效治疗也验证了其存在性[3]。一些促炎性细胞因子在癫痫发作可能会启动炎性信号通路，从而扩大与加剧癫痫的发作[3]。IL-6是主要的促炎性细胞因子之一，在神经系统中起着重要的作用。广泛参与中枢神经系统(central nervous system, CNS)内的免疫调节，可直接或间接影响神经元的分化、发育与功能[4]。IL-6在皮层发育障碍中起着什么样的作用仍然不甚清楚。因此，本研究建立皮层发育障碍大鼠模型，采用匹罗卡品诱导痫性放电，观察IL-6对痫性放电的影响作用。

材料与方法

一、材料

实验动物：SD大鼠孕鼠，购于陆军军医大学实验动物中心。新出生的幼鼠在进行皮层冷冻模型后，置于无特定病原体(specific pathogen free, SPF)动物实验室饲养，自由进食、饮水，室内温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，光/暗周期为12 h/12 h。所有实验均得到遵义医学院动物实验伦理委员会同意，以及按照国家动物与使用条例进行。

二、方法

1.MCD模型制备与分组：对新出生SD大鼠行脑皮质板局部冰冻损伤，以制备MCD动物模型[5]。首先使用低温麻醉，行头皮正中切口，暴露新生鼠大脑皮层组织，将液氮浸泡的低温T型铜针放在靠近正中线的额顶叶皮质表面，时间约持续10 s。然后进行逢合，复温，待幼鼠复苏后，回笼由母鼠继续喂养。实验分组：正常对照组、匹罗卡品组、匹罗卡品+IL6注射组3个组。

2.皮层脑电埋置与记录：取鼠龄为4 w的MCD模型鼠，在水合氯醛浅麻醉状态下，在冰冻部位置入皮层脑电记录电极。然后在电极附近埋置注射管，并且连接塑胶管，以进行IL-6药物注射。然后用牙科水泥将电极固定在头颅上。术后1 w，待动物习惯头部电极后，使用RM6420多通道脑电记录仪记录皮层脑电(成都仪器厂)。见图1。

3.MCD匹罗卡品模型诱导与IL-6的作用：实验小鼠随机分为MCD模型诱导组和MCD模型诱导加IL-6注射组，每组8只。给予实验组大鼠氯化锂腹腔注射(180 mg/kg)，18 h后给予硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，20 min后再给予20 mg/kg匹罗卡品腹腔注射。IL-6注射组给予IL-6剂量为1 μg/g。5 min内注射完。

4.动物行为评价：观察模型鼠的意识状态(清醒、嗜睡、昏睡、昏迷)、生活能力(运动、摄食、饮水、生育)、行为表现(抽搐发作、是否活动增多及兴奋躁动、攻击行为等)。PTZ或生理盐水腹腔注射后，根据Bonan等[6]发作分级量表：0级，正常无癫痫发作；1级，耳朵和面部抽搐，活动过度；2级，身体抽搐起伏，摇头、凝视、震颤等；3 级，前肢阵挛，后肢肌阵挛样抽搐；4级，向侧面翻转、流涎；5 级，翻转到背面朝下，伴全面性强直阵挛发作，癫痫持续状态。

5.统计学处理：计数资料组间采用独立样本t检验，所有数据均使用SPSS 13.00统计软件进行统计处理。

结 果

一、动物行为学观察

所有实验组大鼠注射匹鲁卡品后5～8 min出现眨眼、节律性咀嚼动作。10 min后出现节律性点头，约30 min后出现Ⅳ级以上发作。

二、潜伏期电生理比较

皮层发育不良加匹罗卡品组潜伏期为(25.93±1.33)min；皮层发育不良加IL-6后匹罗卡品组潜伏期为(31.05±2.35)min；与皮层发育不良加匹罗卡品组相比，增加IL-6注射组后潜伏期时间明显延长，具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

三、SE期持续时间

皮层发育不良加匹罗卡品组SE放电典型持续时间为(34.58±1.02) s；皮层发育不良加IL-6后匹罗卡品组潜伏期为(17.75±1.94) s；与皮层发育不良加匹罗卡品组相比，增加IL-6注射组后持续时间明显延长，差异有统计学意义(P<0.01，图3、4)。

四、自发性放电次数

皮层发育不良加匹罗卡品组自发性癫痫放电次数为(28.83±4.26)次/只；皮层发育不良加IL-6后匹罗卡品组自发性癫痫放电次数为(12.00±3.03)次/只；与皮层发育不良加匹罗卡品组相比，增加IL-6注射后自发性放电次数明显减少，统计学意义显著(P<0.01，图5)。

图1 皮层脑电埋置大鼠

Fig 1 Rats were subjected to cortical EEG

图2 IL-6对皮层发育障碍诱发的癫痫潜伏期电生理影响

Fig 2 The effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine

aP<0.05,vsMCD-pilocarpine.

图3 皮层脑电图

Fig 3 Cortical electroencephalogram

A: MCD+pilocarpine; B: MCD-pilocarpine+IL-6.

图4 IL-6对皮层发育障碍诱发的癫痫持续时间电生理影响

Fig 4 The duration time effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine

图5 IL-6对皮层发育障碍诱发的自发性放电生理影响

Fig 5 The effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine

aP<0.01,vsMCD-pilocarpine.

讨 论

很多癫痫病患者通过药物控制可以得到有效治疗和恢复，但超过1/4的癫痫患者在多种药物治疗的情况下，癫痫发作症状仍不能得到有效控制，称之为难治性癫痫[1]。在癫痫的发生、发展过程中，常伴随着神经回路重构、突触重塑等病理改变。近年来发现，癫痫这些病理改变与炎症因子变化密切相关，炎症因子在癫痫发生、发展过程中起着重要的作用[7]。

IL-6是主要由单核-巨噬细胞分泌的具有多种炎性作用的细胞因子。在中枢神经系统(CNS)内，无论在生理条件还是一些神经系统疾病的病理条件下，都可以检测到一定量IL-6的存在。CNS中的IL-6主要由胶质细胞、小胶质细胞、神经元和血管内皮细胞产生[8]。基于动物实验和临床病例的研究表明，癫痫发作持续状态后，患者脑脊液或者血浆中可以立即检测到IL-6含量升高[9]。另有临床标本研究发现，IL-6在MCD(Ⅱ 型)患者与多发性节结性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)患者手术标本中明显高表达，患者癫痫发作后的血浆和脑脊液中，人可溶性白细胞介素6受体(human soluble interleukin 6 receptor, sIL-6R)的含量显著升高，并且与进一步分子水平的研究通过采用Western Blot和逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术研究发现，在TSC和MCD病灶中，白细胞介素-6(IL-6)的蛋白和mRNA的表达水平显著高于病灶周围正常脑组织[10]。这些研究提示，IL-6信号因子或IL-6转导相关的分子可能参与MCD癫痫的发生或发展过程[10]。但是对IL-6对在体MCD的功能研究仍然不甚清楚。

我们的研究显示，IL-6注射后可以有效延长潜伏期时间，说明IL-6可以降低癫痫发作的阈值。有研究证实,IL-6敲除小鼠显著增加戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate, NMDA)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(alpha-amino-3 hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate, AMPA)和红藻氨酸(kainic acid, KA)癫痫敏感性。结合这些数据说明，IL-6在癫痫发作中可能起着保护作用。同样，在皮质发育障碍动物模型中，IL-6同样可以降低癫痫敏感性。细胞因子的主要功能是作为免疫系统介导体，是由中枢神经系统的神经胶质细胞分泌，细胞因子可以是促炎或抗炎[11]。即使这种情况是发生在亚临床或出现在出生时，由炎症级联反应诱导多种细胞因子可能会导致神经元变性，对脑组织神经毒性作用，并导致癫痫发作和发展。

另有研究发现，小鼠IL-6敲除后，在中枢神经系统中一些兴奋性神经递质更容易激活。在我们的研究中发现，应用IL-6后可以减少癫痫持续时间与自发性癫痫行为学的发生,说明IL-6在癫痫过程中起着保护作用。这可能与IL-6能够抑制其它炎症因子等有关[10]。并且有体外实验也证实，IL-6的慢性刺激可以降低II型代谢型谷氨酸受体和L-型钙通道[12]。我们推测，IL-6对癫痫的功能可能涉及到一些神经递质的释放，影响到兴奋性神经元与抑制性神经元的调控。但是具体影响因子仍然需要进一步的研究证实。

另外，IL-6的功能也有不同的研究结论。如有研究却证实，IL-6对培养中的神经发育以及对NMDA刺激反应过程中有损害作用，提示IL-6对神经的影响功能是致炎作用，而非抗炎效应[13]。由此可见，IL-6的功能定位目前并不能完全明确，在不同的条件下起着不同的作用，有的作用下有明显的保护作用，有的情况下起着恶性作用。

总之，我们通过皮层内注射方法，观察IL-6可以有效减少MCD模型癫痫放电持续时间与自发性行为学的发生，提示IL-6起着一定的保护作用。但由于多种因素，IL-6信号因子在MCD的功能和介导作用机制仍需要进一步研究。

参 考 文 献

1WONG M. Mechanisms of epileptogenesis in tuberous sclerosis complex and related malformations of cortical development with abnormal glioneuronal proliferation [J]. Epilepsia, 2008, 49(1): 8-21.

2CEPEDA C, ANDRÉ V M, WU N, et al. Immature neurons and GABA networks may contribute to epileptogenesis in pediatric cortical dysplasia [J]. Epilepsia, 2007, 48(Suppl 5): 79-85.

3VEZZANI A, FRENCH J, BARTFAI T, et al. The role of inflammation in epilepsy [J]. Nat Rev Neurol, 2011, 7(1): 31-40.

4MCPHERSON C A, AOYAMA M, HARRY G J. Interleukin (IL)-1 and IL-6 regulation of neural progenitor cell proliferation with hippocampal injury: differential regulatory pathways in the subgranular zone (SGZ) of the adolescent and mature mouse brain [J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(5): 850-862.

5GÜRSES C, ORHAN N, AHISHALI B, et al. Topiramate reduces blood-brain barrier disruption and inhibits seizure activity in hyperthermia-induced seizures in rats with cortical dysplasia [J]. Brain Res, 2013, 1494(4): 91-100.

6BONAN C D, AMARAL O B, ROCKENBACH I C, et al. Altered ATP hydrolysis induced by pentylenetetrazol kindling in rat brain synaptosomes [J]. Neurochem Res, 2000, 25(6): 775-779.

7FABENE P F, BRAMANTI P, CONSTANTIN G. The emerging role for chemokines in epilepsy [J]. J Neuroimmunol, 2010, 224(1/2): 22-27.

8JUTTLER E, TARABIN V, SCHWANINGER M. Interleukin-6 (IL-6): a possible neuromodulator induced by neuronal activity [J]. Neuroscientist, 2002, 8(3): 268-275.

9LEHTIMAKI K A, PELTOLA J, KOSKIKALLIO E, et al. Expression of cytokines and cytokine receptors in the rat brain after kainic acid-induced seizures [J]. Brain Res Mol Brain Res, 2003, 110(2): 253-260.

10SHU H F, ZHANG C Q, YIN Q, et al. Expression of the interleukin 6 system in cortical lesions from patients with tuberous sclerosis complex and focal cortical dysplasia type IIb [J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2010, 69(8): 838-849.

11YOUN Y, SUNG I K, LEE I G. The role of cytokines in seizures: interleukin (IL)-1β, IL-1Ra, IL-8, and IL-10 [J]. Korean J Pediatr, 2013, 56(7): 271-274.

12VEREYKEN E J, BAJOVA H, CHOW S, et al. Chronic interleukin-6 alters the level of synaptic proteins in hippocampus in culture and in vivo [J]. Eur J Neurosci, 2007, 25(12): 3605-3616.

13CONROY S M, NGUYEN V, QUINA L A, et al. Interleukin-6 produces neuronal loss in developing cerebellar granule neuron cultures [J]. J Neuroimmunol, 2004, 155(1/2): 43-54.