李筹忠 高方友* 孙杰
(1贵州省人民医院神经外科; 2贵航300医院神经外科,贵州 贵阳 550000)
皮质发育障碍(malformations of cortical development, MCD)又被称为皮质发育畸形及皮质发育不良等。是一类神经发育不良疾病的总称,是难治性癫痫和精神发育迟滞的主要病因。根据流行病学调查,局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia, MCD)和结节性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)是最常见的伴发药物难治性癫痫的两类MCD,具有相同的病理学特征,也是研究 MCD 致痫机制常用的疾病模型[1]。引起其致痫的主要原因为MCD病灶中的异构神经元具有典型的过度兴奋性,甚至可自发产生痫样放电活动[2]。皮质发育障碍是难治性癫痫的重要病因之一,目前机制尚不完全明确。
近年一些研究提示,免疫炎症反应在癫痫的发生、发展过程中具有重要作用,细胞免疫和体液免疫均参与其中,相应的抗炎和免疫抑制在一定程度上有效治疗也验证了其存在性[3]。一些促炎性细胞因子在癫痫发作可能会启动炎性信号通路,从而扩大与加剧癫痫的发作[3]。IL-6是主要的促炎性细胞因子之一,在神经系统中起着重要的作用。广泛参与中枢神经系统(central nervous system, CNS)内的免疫调节,可直接或间接影响神经元的分化、发育与功能[4]。IL-6在皮层发育障碍中起着什么样的作用仍然不甚清楚。因此,本研究建立皮层发育障碍大鼠模型,采用匹罗卡品诱导痫性放电,观察IL-6对痫性放电的影响作用。
一、材料
实验动物:SD大鼠孕鼠,购于陆军军医大学实验动物中心。新出生的幼鼠在进行皮层冷冻模型后,置于无特定病原体(specific pathogen free, SPF)动物实验室饲养,自由进食、饮水,室内温度20~25 ℃,相对湿度40%~70%,光/暗周期为12 h/12 h。所有实验均得到遵义医学院动物实验伦理委员会同意,以及按照国家动物与使用条例进行。
二、方法
1.MCD模型制备与分组:对新出生SD大鼠行脑皮质板局部冰冻损伤,以制备MCD动物模型[5]。首先使用低温麻醉,行头皮正中切口,暴露新生鼠大脑皮层组织,将液氮浸泡的低温T型铜针放在靠近正中线的额顶叶皮质表面,时间约持续10 s。然后进行逢合,复温,待幼鼠复苏后,回笼由母鼠继续喂养。实验分组:正常对照组、匹罗卡品组、匹罗卡品+IL6注射组3个组。
2.皮层脑电埋置与记录:取鼠龄为4 w的MCD模型鼠,在水合氯醛浅麻醉状态下,在冰冻部位置入皮层脑电记录电极。然后在电极附近埋置注射管,并且连接塑胶管,以进行IL-6药物注射。然后用牙科水泥将电极固定在头颅上。术后1 w,待动物习惯头部电极后,使用RM6420多通道脑电记录仪记录皮层脑电(成都仪器厂)。见图1。
3.MCD匹罗卡品模型诱导与IL-6的作用:实验小鼠随机分为MCD模型诱导组和MCD模型诱导加IL-6注射组,每组8只。给予实验组大鼠氯化锂腹腔注射(180 mg/kg),18 h后给予硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射,20 min后再给予20 mg/kg匹罗卡品腹腔注射。IL-6注射组给予IL-6剂量为1 μg/g。5 min内注射完。
4.动物行为评价:观察模型鼠的意识状态(清醒、嗜睡、昏睡、昏迷)、生活能力(运动、摄食、饮水、生育)、行为表现(抽搐发作、是否活动增多及兴奋躁动、攻击行为等)。PTZ或生理盐水腹腔注射后,根据Bonan等[6]发作分级量表:0级,正常无癫痫发作;1级,耳朵和面部抽搐,活动过度;2级,身体抽搐起伏,摇头、凝视、震颤等;3 级,前肢阵挛,后肢肌阵挛样抽搐;4级,向侧面翻转、流涎;5 级,翻转到背面朝下,伴全面性强直阵挛发作,癫痫持续状态。
5.统计学处理:计数资料组间采用独立样本t检验,所有数据均使用SPSS 13.00统计软件进行统计处理。
一、动物行为学观察
所有实验组大鼠注射匹鲁卡品后5~8 min出现眨眼、节律性咀嚼动作。10 min后出现节律性点头,约30 min后出现Ⅳ级以上发作。
二、潜伏期电生理比较
皮层发育不良加匹罗卡品组潜伏期为(25.93±1.33)min;皮层发育不良加IL-6后匹罗卡品组潜伏期为(31.05±2.35)min;与皮层发育不良加匹罗卡品组相比,增加IL-6注射组后潜伏期时间明显延长,具有统计学意义(P<0.05)。见图2。
三、SE期持续时间
皮层发育不良加匹罗卡品组SE放电典型持续时间为(34.58±1.02) s;皮层发育不良加IL-6后匹罗卡品组潜伏期为(17.75±1.94) s;与皮层发育不良加匹罗卡品组相比,增加IL-6注射组后持续时间明显延长,差异有统计学意义(P<0.01,图3、4)。
四、自发性放电次数
皮层发育不良加匹罗卡品组自发性癫痫放电次数为(28.83±4.26)次/只;皮层发育不良加IL-6后匹罗卡品组自发性癫痫放电次数为(12.00±3.03)次/只;与皮层发育不良加匹罗卡品组相比,增加IL-6注射后自发性放电次数明显减少,统计学意义显著(P<0.01,图5)。
图1 皮层脑电埋置大鼠
Fig 1 Rats were subjected to cortical EEG
图2 IL-6对皮层发育障碍诱发的癫痫潜伏期电生理影响
Fig 2 The effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine
aP<0.05,vsMCD-pilocarpine.
图3 皮层脑电图
Fig 3 Cortical electroencephalogram
A: MCD+pilocarpine; B: MCD-pilocarpine+IL-6.
图4 IL-6对皮层发育障碍诱发的癫痫持续时间电生理影响
Fig 4 The duration time effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine
图5 IL-6对皮层发育障碍诱发的自发性放电生理影响
Fig 5 The effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine
aP<0.01,vsMCD-pilocarpine.
很多癫痫病患者通过药物控制可以得到有效治疗和恢复,但超过1/4的癫痫患者在多种药物治疗的情况下,癫痫发作症状仍不能得到有效控制,称之为难治性癫痫[1]。在癫痫的发生、发展过程中,常伴随着神经回路重构、突触重塑等病理改变。近年来发现,癫痫这些病理改变与炎症因子变化密切相关,炎症因子在癫痫发生、发展过程中起着重要的作用[7]。
IL-6是主要由单核-巨噬细胞分泌的具有多种炎性作用的细胞因子。在中枢神经系统(CNS)内,无论在生理条件还是一些神经系统疾病的病理条件下,都可以检测到一定量IL-6的存在。CNS中的IL-6主要由胶质细胞、小胶质细胞、神经元和血管内皮细胞产生[8]。基于动物实验和临床病例的研究表明,癫痫发作持续状态后,患者脑脊液或者血浆中可以立即检测到IL-6含量升高[9]。另有临床标本研究发现,IL-6在MCD(Ⅱ 型)患者与多发性节结性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)患者手术标本中明显高表达,患者癫痫发作后的血浆和脑脊液中,人可溶性白细胞介素6受体(human soluble interleukin 6 receptor, sIL-6R)的含量显著升高,并且与进一步分子水平的研究通过采用Western Blot和逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术研究发现,在TSC和MCD病灶中,白细胞介素-6(IL-6)的蛋白和mRNA的表达水平显著高于病灶周围正常脑组织[10]。这些研究提示,IL-6信号因子或IL-6转导相关的分子可能参与MCD癫痫的发生或发展过程[10]。但是对IL-6对在体MCD的功能研究仍然不甚清楚。
我们的研究显示,IL-6注射后可以有效延长潜伏期时间,说明IL-6可以降低癫痫发作的阈值。有研究证实,IL-6敲除小鼠显著增加戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate, NMDA)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(alpha-amino-3 hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate, AMPA)和红藻氨酸(kainic acid, KA)癫痫敏感性。结合这些数据说明,IL-6在癫痫发作中可能起着保护作用。同样,在皮质发育障碍动物模型中,IL-6同样可以降低癫痫敏感性。细胞因子的主要功能是作为免疫系统介导体,是由中枢神经系统的神经胶质细胞分泌,细胞因子可以是促炎或抗炎[11]。即使这种情况是发生在亚临床或出现在出生时,由炎症级联反应诱导多种细胞因子可能会导致神经元变性,对脑组织神经毒性作用,并导致癫痫发作和发展。
另有研究发现,小鼠IL-6敲除后,在中枢神经系统中一些兴奋性神经递质更容易激活。在我们的研究中发现,应用IL-6后可以减少癫痫持续时间与自发性癫痫行为学的发生,说明IL-6在癫痫过程中起着保护作用。这可能与IL-6能够抑制其它炎症因子等有关[10]。并且有体外实验也证实,IL-6的慢性刺激可以降低II型代谢型谷氨酸受体和L-型钙通道[12]。我们推测,IL-6对癫痫的功能可能涉及到一些神经递质的释放,影响到兴奋性神经元与抑制性神经元的调控。但是具体影响因子仍然需要进一步的研究证实。
另外,IL-6的功能也有不同的研究结论。如有研究却证实,IL-6对培养中的神经发育以及对NMDA刺激反应过程中有损害作用,提示IL-6对神经的影响功能是致炎作用,而非抗炎效应[13]。由此可见,IL-6的功能定位目前并不能完全明确,在不同的条件下起着不同的作用,有的作用下有明显的保护作用,有的情况下起着恶性作用。
总之,我们通过皮层内注射方法,观察IL-6可以有效减少MCD模型癫痫放电持续时间与自发性行为学的发生,提示IL-6起着一定的保护作用。但由于多种因素,IL-6信号因子在MCD的功能和介导作用机制仍需要进一步研究。
参 考 文 献
1WONG M. Mechanisms of epileptogenesis in tuberous sclerosis complex and related malformations of cortical development with abnormal glioneuronal proliferation [J]. Epilepsia, 2008, 49(1): 8-21.
2CEPEDA C, ANDRÉ V M, WU N, et al. Immature neurons and GABA networks may contribute to epileptogenesis in pediatric cortical dysplasia [J]. Epilepsia, 2007, 48(Suppl 5): 79-85.
3VEZZANI A, FRENCH J, BARTFAI T, et al. The role of inflammation in epilepsy [J]. Nat Rev Neurol, 2011, 7(1): 31-40.
4MCPHERSON C A, AOYAMA M, HARRY G J. Interleukin (IL)-1 and IL-6 regulation of neural progenitor cell proliferation with hippocampal injury: differential regulatory pathways in the subgranular zone (SGZ) of the adolescent and mature mouse brain [J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(5): 850-862.
5GÜRSES C, ORHAN N, AHISHALI B, et al. Topiramate reduces blood-brain barrier disruption and inhibits seizure activity in hyperthermia-induced seizures in rats with cortical dysplasia [J]. Brain Res, 2013, 1494(4): 91-100.
6BONAN C D, AMARAL O B, ROCKENBACH I C, et al. Altered ATP hydrolysis induced by pentylenetetrazol kindling in rat brain synaptosomes [J]. Neurochem Res, 2000, 25(6): 775-779.
7FABENE P F, BRAMANTI P, CONSTANTIN G. The emerging role for chemokines in epilepsy [J]. J Neuroimmunol, 2010, 224(1/2): 22-27.
8JUTTLER E, TARABIN V, SCHWANINGER M. Interleukin-6 (IL-6): a possible neuromodulator induced by neuronal activity [J]. Neuroscientist, 2002, 8(3): 268-275.
9LEHTIMAKI K A, PELTOLA J, KOSKIKALLIO E, et al. Expression of cytokines and cytokine receptors in the rat brain after kainic acid-induced seizures [J]. Brain Res Mol Brain Res, 2003, 110(2): 253-260.
10SHU H F, ZHANG C Q, YIN Q, et al. Expression of the interleukin 6 system in cortical lesions from patients with tuberous sclerosis complex and focal cortical dysplasia type IIb [J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2010, 69(8): 838-849.
11YOUN Y, SUNG I K, LEE I G. The role of cytokines in seizures: interleukin (IL)-1β, IL-1Ra, IL-8, and IL-10 [J]. Korean J Pediatr, 2013, 56(7): 271-274.
12VEREYKEN E J, BAJOVA H, CHOW S, et al. Chronic interleukin-6 alters the level of synaptic proteins in hippocampus in culture and in vivo [J]. Eur J Neurosci, 2007, 25(12): 3605-3616.
13CONROY S M, NGUYEN V, QUINA L A, et al. Interleukin-6 produces neuronal loss in developing cerebellar granule neuron cultures [J]. J Neuroimmunol, 2004, 155(1/2): 43-54.