丹皮酚对高脂血症大鼠肝脏脂质代谢及自噬的影响

董兆旻，谢先梅，孙 颖，戴 敏

(安徽中医药大学 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230012)

高脂血症是指生物体内脂质代谢失常，是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生的主要诱因和早期病变。肝脏是脂质代谢的主要器官，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是脂质代谢关键性转录调节者，调节肝脏脂质代谢可促进巨噬细胞胆固醇流出，减少脂质积累，防止泡沫细胞形成，抑制AS的形成[1]。自噬是细胞对外界环境压力变化的一种反应，是在自噬相关基因调控下通过溶酶体来降解细胞内受损的细胞器及大分子物质的过程，并能为细胞提供自我更新的营养及材料，使其能在饥饿和各种应激环境下维持自身稳态[2-3]。自噬在AS发生发展的不同阶段可能发挥着重要的作用[4]，微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ型(microtubule-associated protein 1 light 3, type 2，LC3Ⅱ)、p62表达水平可作为衡量自噬水平的重要指征。然而在AS发病前期肝脏脂质代谢紊乱时自噬处于何种状态目前尚未见报道。丹皮酚(paeonol，Pae)是从毛茛科植物牡丹(PaeoniaSuffruticoasAndr.)的干燥根皮中提取的主要活性成分之一，具有调脂和抗AS作用[5-7]，还能调控自噬相关基因的表达[8]。至今还没有研究证实Pae对高脂状态下肝脏自噬水平的影响。本研究探索Pae对高脂血症大鼠肝脏脂质代谢及自噬的影响，为进一步揭示Pae抗AS早期病变的作用机制提供依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 Pae(纯度99%，批号 20170306)：安徽省宣城百草植物工贸有限公司；雷帕鸣(含雷帕霉素1 mg，批号 S70704)：美国惠氏制药；立普妥(含阿托伐他汀片10 mg，批号 S87401)：美国惠氏制药；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：上海试剂一厂；维生素D2注射液(批号 16112601)：江西赣南海欣药业股份有限公司；LC3抗体(ab128025)、PPARγ抗体(ab209350)、p62抗体(ab56416)：美国Abcam公司。

1.2 实验动物 SPF级7～8周龄雄性SD大鼠70只，体质量(200±20)g，购自安徽医科大学实验动物中心[动物使用许可证号：SCXK(皖)2017-001]，饲养于安徽中医药大学实验动物中心动物房中，在温度20～24 ℃，相对湿度45%～65%，光照/黑暗周期为12 h/12 h的条件下饲养，动物实验设计征得安徽中医药大学实验动物伦理委员会同意。

1.3 主要仪器 CK2型倒置显微镜：日本Olympus公司；倒置荧光显微镜：德国Leica公司；H-7650透射电子显微镜：日本Hitachi公司。

2 方法

2.1 分组与给药 将56只SD大鼠适应性喂养1周后，随机均分7组(每组8只)：正常对照组，模型组，Pae高、中、低剂量组，雷帕霉素组，阿托伐他汀组。在模型复制同时，正常对照组和模型组给予等容量0.5% CMC-Na，Pae高、中、低剂量组分别给予含Pae 300、150、75 mg/kg的0.5% CMC-Na，雷帕霉素组给予含雷帕霉素0.2 mg/kg的0.5% CMC-Na，阿托伐他汀组给予含阿托伐他汀5 mg/kg的0.5% CMC-Na。灌胃容积为10 mL/kg，每日1次，连续6周。

2.2 模型复制 正常对照组给予普通饲料喂养，模型组给予高脂饲料(3%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%猪油，81.3%基础饲料)喂养，除正常对照组外，在高脂饲料喂养前，其余各组大鼠一次性腹腔注射维生素D260万U/kg。每周称体质量，根据体质量调整给药量，所有动物自由饮水，连续喂养6周。

2.3 脂质水平检测 大鼠禁食不禁水12 h后，称质量，采用3.5%水合氯醛生理盐水溶液10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉分叉处取血，3 000 r/min离心10 min，得血清，备用。取大鼠肝右叶尖同一部位，准确称取0.2 g，按1∶9[质量(g)∶体积(mL)]的比例，加入9倍的无水乙醇1.8 mL，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r/min，离心10 min，取上清液。将血清及肝匀浆上清液通过全自动生化分析仪测定血清及肝脏的总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)水平。

2.4 肝系数水平的检测 动物处死后，取肝脏，置冰冷的生理盐水中反复冲洗，剔除脂肪及结缔组织。滤纸吸干表面水分后准确称质量，计算肝质量系数(肝质量/体质量)。

2.5 肝脏组织形态学积分标准 取肝脏左叶尖同一部位，用10%中性甲醛固定，组织标本脱水，常规石蜡包埋，均匀间断切片，切片厚度3 μm。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。于显微镜下观察主动脉组织病理改变。计算机病理图像分析软件测定，对结果进行量化。①肝脏脂肪变性程度评分：根据脂肪变性累计体积占肝组织体积百分比划分等级并计分，<5%，计0分；5%～33%，计1分；>33%，且≤66%，计2分；>66%，计3分。

2.6 电镜下观察肝脏自噬小体 每组随机抽取3只大鼠，取大鼠肝左叶同一部位，切成1 mm3左右，迅速固定于2.5%戊二醛中，置4 ℃冰箱，充分固定后，用0.1 mol/L磷酸缓冲液充分清洗，1%锇酸中固定1 h。再按50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、90%丙酮、90%丙酮、100%丙酮的顺序进行梯度脱水，每梯度脱水2次，每次5 min。纯环氧树脂包埋剂包理，超薄切片，经醋酸双氧铀、枸橼铅双重染色，各10 min，透射电镜下观察各组大鼠肝细胞中自噬小体的数量、结构及其包裹物质，拍照记录。

2.7 免疫组织化学法检测肝脏PPARγ、LC3Ⅱ、p62表达水平 采用免疫组织化学二步法检测肝脏PPARγ、LC3Ⅱ、p62的表达水平，于显微镜下观察，采用Image-Pro Plus图像分析软件对阳性率(总阳性面积/图片总面积×100%)进行量化。

3 结果

3.1 Pae对高脂血症大鼠血清和肝脏脂质水平及肝系数的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清和肝脏中TG、TC水平和肝系数均显著增加(P<0.05)，提示大鼠高脂血症模型复制成功。Pae高、中、低剂量组大鼠血清和肝脏中TG、TC水平和肝系数呈剂量依赖性地降低，与阿托伐他汀组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示Pae具有改善血脂紊乱的作用。见表1。

表1 Pae对高脂血症大鼠脂质水平及肝系数的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 Pae对高脂血症大鼠肝脏组织形态的影响 HE染色显示，正常对照组大鼠肝脏细胞结构清晰，形态排列正常，肝细胞的结构完整，中央有核，胞质均匀，无脂滴；模型组大鼠肝脏细胞排列紊乱，部分肝细胞肿胀，细胞核固缩，细胞内出现大量空泡样变性，为重度肝细胞变性；各给药组大鼠肝脏细胞脂肪变性程度减轻，脂滴数量减少，有一定程度的改善。定量分析结果显示，模型组大鼠肝脏脂肪变性评分(2.75±0.50)较正常对照组(0.25±0.50)显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；Pae低、中、高剂量组和阿托伐他汀组大鼠肝脏脂肪变性评分分别为(2.00±0.00)、(1.50±0.58)、(1.25±0.50)、(1.25±0.50)，较模型组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

注:A.正常对照组;B.模型组;C.阿托伐他汀组;D. Pae低剂量组;E. Pae中剂量组;F. Pae高剂量组图1 Pae对高脂血症大鼠肝脏脂肪病变的影响(HE染色,10×40倍,n=8)

3.3 电镜下各组高脂血症大鼠肝脏组织自噬小体变化比较 正常对照组肝脏细胞质中未见自噬小体；模型组肝脏细胞质中可见大量脂质体，可见少量自噬体及被包裹的降解物；Pae低、中、高剂量组肝脏细胞质中可见较多的自噬体及被包裹的降解物，脂滴的数量较模型组减少，且随Pae剂量增加，自噬体数量逐渐增加；雷帕霉素组肝脏细胞质中可见较多的自噬体及被包裹的降解物。见图2。

3.4 Pae对大鼠肝脏PPARγ、LC3Ⅱ、P62表达的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏LC3Ⅱ表达水平显著减少(P<0.05)，p62和PPAR-γ表达水平显著增加(P<0.05)。与模型组相比较，Pae高、中、低剂量组，雷帕霉素组LC3Ⅱ表达水平显著上升(P<0.05)，p62表达水平显著降低(P<0.05)，Pae对大鼠肝脏LC3Ⅱ和p62的效应呈现一定的剂量依赖性；Pae中、高剂量组和阿托伐他汀组PPAR-γ表达水平显著上升(P<0.05)。见图3、图4。

注:A.正常对照组;B.模型组;C.雷帕霉素组;D. Pae低剂量组;E. Pae中剂量组;F. Pae高剂量组图2 电镜下各组大鼠肝脏组织自噬小体变化比较(×4 000倍)

4 讨论

高脂血症是一种临床常见而多发的代谢性疾病，是因生物体内脂代谢异常导致血浆内脂质浓度高于正常水平的一种疾病，是导致动脉粥样硬化、冠心病等重要危险因素之一。本研究中，采用大剂量腹腔注射维生素D2与高脂饲料喂养后大鼠血脂和肝脂水平明显升高，结合对高脂大鼠肝脏病理学结果的分析，均表明高脂模型复制成功。脂质水平检测结果显示，Pae通过降低血浆及肝脏中TC、TG达到干预高脂血症病变发展的作用，同时肝系数的比较结果也提示Pae具有抑制高脂血症病变发展的作用。PPARγ是脂质代谢关键性转录调节因子，同时具有调节血脂等作用，可作为衡量脂质代谢水平的标志因子。本研究结果显示，Pae可提高PPARγ的表达水平，且与阿托伐他汀组无明显差异。说明Pae对高脂大鼠肝脏脂质代谢具有促进作用。

图3 各组大鼠肝脏LC3Ⅱ、P62、PPARγ表达水平(免疫组织化学染色法，10×40倍)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

脂质代谢紊乱是高脂血症发生的根本原因，一般情况下脂质代谢有两种途径：一是通过胞质中性化水解酶降解脂质进行的；二是通过自噬溶酶体降解脂质进行的[9]，该途径与自噬相关。近年来有不少研究显示，自噬与脂质代谢的关系是相互作用的，抑制自噬会阻碍脂质代谢，使细胞内脂质含量增加[10-11]；同时细胞内脂质含量增加会反向调节自噬，使自噬受到抑制，这种相互关系可能会使细胞陷入恶性循环，抑制自噬会促进脂质积累，进而进一步抑制自噬功能，从而增加脂质积累，最终导致高脂血症、动脉粥样硬化等疾病。本研究采用电镜观察，发现Pae组大鼠肝脏细胞质中可见较多的自噬体及被包裹的降解物，脂滴的数量较模型组减少，且随Pae剂量增加，自噬体数量依次增加，表明Pae促进脂质代谢的同时伴随自噬发生，且自噬程度随Pae剂量增加而提升。LC3Ⅱ是自噬体膜上的标记蛋白，可作为自噬发生的分子标志物，而p62是一种多功能蛋白，既是连接自噬体与泛素化标记蛋白质聚合体的桥梁，同时也是自噬过程的选择性底物，可作为自噬能力的指征[12-13]。为了进一步研究Pae与自噬和脂质代谢的关系，本研究采用免疫组织化学法检测各组LC3Ⅱ、P62的表达水平，发现Pae可促进LC3Ⅱ表达，抑制p62表达，且与雷帕霉素组无显著性差异。说明Pae可激活自噬相关因子LC3Ⅱ、p62的表达。

本研究在建立高脂血症模型基础上，探讨Pae对脂质代谢和自噬均有明显的调节作用，然而尚不清楚Pae的调节血脂作用与自噬的关系，本课题组将在后续研究中作更深入的探讨。