野生延胡索块茎组织结构与生物碱组织化学定位

钟意欣禾，胡 珂，彭华胜，彭代银

(安徽中医药大学药学院 安徽省道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 230012)

中药延胡索为罂粟科多年生植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的干燥块茎[1]，自唐代起就有其入药的相关记载。如今使用的延胡索多产于浙江，在陕西汉中等地也有大面积的引种栽培[2]。延胡索块茎主要含生物碱，可分为原小檗碱类、阿朴啡类、原阿片碱类、异喹啉苯并菲啶类等[3]。现代药理学研究发现，这些生物碱能作用于神经系统、心血管系统，起到镇痛、降低吗啡成瘾性、保护心肌细胞、抗心律失常、抗血栓等多种作用。本研究通过对栽培延胡索的基原植物——生延胡索进行适时跟踪采集，观察不同时期其块茎各部分组织的生长规律及生物碱的分布状况，以期为今后促进延胡索有效生物碱成分的积累提供依据。

1 材料、试剂及仪器

1.1 材料 2016年11月至2017年4月，每月在安徽省合肥市大蜀山北坡采集一年及多年生野生延胡索新鲜块茎，经安徽中医药大学胡珂教授鉴定为罂粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的块茎。

1.2 仪器 旋转型石蜡切片机(Leica RM2265)：德国；烘干机；烘片机(Leica HI1220)：上海徕卡仪器有限公司；光学显微镜(Olypus BH2)；冰冻切片机(Leica CM1850UV)；荧光显微镜(Olympus BX51)；显微摄像仪。

1.3 试剂 FAA固定液(70%乙醇-冰醋酸-甲醛，18∶1∶1)：上海聚泰特种试剂有限公司；浓度梯度乙醇(分析纯)、浓度梯度二甲苯(分析纯)：上海润捷化学试剂有限公司；石蜡；藏红T、固绿：上海源叶生物科技有限公司；中性树胶；胶水。

2 方法

2.1 延胡索块茎石蜡切片的制作与观察 于2016年11月至2017年4月每月在大蜀山挖取一年生及多年生延胡索块茎若干，带土转移至实验室后用FAA固定液固定。常规制作石蜡切片后置光学显微镜下观察、拍摄照片并记录。

2.2 延胡索块茎冰冻切片的制作与观察 冰冻切片的冷冻温度和冷冻时间对切片质量有很大的影响[4]，因此在经过一系列尝试后最终以冷冻箱温度-18 ℃、冷冻15 min为条件，切25 μm的薄片后直接放于荧光显微镜下观察，拍摄照片并记录。

2.3 阴性对照 将切好的延胡索薄片用酸性醇溶液处理洗脱其中的生物碱后，放在荧光显微镜下观察，拍摄照片并记录。

3 结果

3.1 多年生块茎的组织结构变化 延胡索多年生块茎的地下形态在休眠期为结实饱满的球形，直至3月份地上部分开花期间，块茎外部质地变得松泡，内部产生饱满的新生块茎。其显微结构类似于茎的初生构造，从外向内分别为木栓层、皮层薄壁组织、形成层以及髓。没有明显的木栓形成层，且形成层处产生“生长点”，若产生一个以上的生长点则呈对称分布。“生长点”于1月份开始经2～3个月分生扩大成新的块茎，其以外的薄壁组织淀粉粒减少，纤维化成为颓废组织。见图1。

3.2 一年生块茎的组织结构变化 延胡索一年生块茎可以由种子直接发育形成，或由多年生块茎的地下横走茎节处膨大产生。前者为未充分发育的块茎结构[5]，后者由于其产生位置处会形成一个凹痕，在野生条件下比较容易区分，因此用于制作石蜡切片。结果显示其显微结构与多年生块茎相似，只是形成层常成不规则状。见图2。

3.3 延胡索块茎生物碱分布规律 荧光显微镜下可见延胡索的新鲜冰冻切片除形成层外几乎所有部分都发黄绿色荧光。其中靠近木栓层部分的皮层薄壁组织荧光强度要高于其他部分。新生块茎的皮层薄壁组织亮度也较高。一年生块茎的凹陷处木栓化细胞呈现不同的黄色。在块茎出现松泡后，破碎的薄壁细胞也呈现亮黄绿色荧光。阴性对照显示在洗去生物碱后皮层薄壁组织几乎没有明显的荧光差异，而木栓层依旧较亮。见图3。

4 讨论

4.1 延胡索块茎的组织发育特点 延胡索块茎的组织结构大体分为木栓层、皮层薄壁组织、形成层以及髓4个部分，并依靠其形成层上随机产生的具有强烈分生能力的“生长点”，以一年为周期进行新旧交替。野生延胡索“生长点”常为2个，而有资料显示栽培品种可见2～3个，且都呈对称分布[6]。可见其产生与营养物质有着密切的联系，而促进“生长点”产生可使其繁殖率得到提高。与此同时，淀粉作为植物储存能量的一种方式，也跟随块茎的新旧交替产生消长变化。因此，延胡索在夏初地上茎枯萎时采收，此时延胡索已经完成了新旧代替，淀粉粒含量充足，产量质量最佳。

注:A、B、D.不规则的形成层;C.可见生长点;E.向两边延伸的形成层;F.疏松的原皮层薄壁细胞,扩大且占主要位置的生长点;向左箭头指向形成层,向上箭头指向生长点,向下箭头指向新形成层,向右箭头指向原生导管,右上箭头指向原皮层薄壁细胞;标尺示200 μm图2 一年生延胡索石蜡切片(4×10倍)

4.2 生物碱的积累规律 生物碱是一种在植物的生长发育过程中起到重要作用的次生代谢产物，存在于100多个科的植物中[7]。延胡索中生物碱成分在紫外光下受到激发后会呈现黄绿色荧光，并且荧光强度与含量成正比[8]，因此能在荧光显微镜下直观地看到生物碱在其块茎中的分布特点。

有研究显示，植物次生代谢产物总是分布在易受侵害的组织中，而本实验结果显示，在不同生长时期延胡索中几乎各个组织部位均含有生物碱，其中靠近木栓层内部的生物碱含量较高。木栓层是进行次生生长的植物的重要保护组织，因此二者是相符合的。但由于延胡索中含有大量淀粉粒以及具有强烈荧光反应的木质素可能会对荧光反应的结果产生干扰，且酸对木质素没有影响[9]，因此，本研究观察单纯淀粉粒的荧光反应以及利用酸性醇溶液对生物碱进行抽提后的块茎切片，结果显示单纯的淀粉粒在荧光显微镜下并没有显示荧光，这可能与其荧光强度太弱有关；而提取生物碱后，靠近木栓层内侧的荧光差异消失。由此可见，生物碱在块茎中的分布是具有差异的，且这种差异并不随时间的变化而产生不同部位的定向聚集性。

注:A.木栓层内侧明显较亮(多年生块茎,×10倍);B.外侧皮层薄壁组织较亮(多年生块茎,×5倍);C.纤维化的皮层薄壁组织(多年生块茎,×5倍);D.新生块茎荧光显微(多年生块茎,×5倍);E.靠近凹陷部分的导管呈黄色(一年生块茎,×5倍);F.阴性对照(多年生块茎,×5倍);向左箭头指向木栓层,向下箭头指向外皮层,向上箭头指向纤维皮层;A中标尺为100 μm,其余图片中标尺皆为200 μm图3 新鲜延胡索块茎冰冻切片

在皮层薄壁组织发生松软破裂时，其仍具有较高的生物碱含量，由此推测这些化学物质可能具有一定的防御作用，而一年生块茎凹陷处的木栓化细胞呈现颜色不同的黄色荧光，提示此处的生物碱成分可能不同。另外，许多研究显示生物碱在植物中的积累还受到环境及生物因子的影响，如无机物的供给、温度、海拔、真菌的攻击[10]，因此对于延胡索块茎中生物碱分布的影响因素还可进一步深入研究。

4.3 生物碱分布与淀粉粒的关系 皮层薄壁组织荧光强度随着淀粉粒的增加而增加，而没有淀粉粒的形成层部位则几乎没有荧光，推测其生物碱含量可能与淀粉粒有关。有相关文献显示，贝母栽培品种的生物碱含量与淀粉粒的积累无规律的相关，而野生品种则与淀粉含量呈正相关[11]。究竟此类以地下茎入药的植物生物碱含量与淀粉粒的产生有何联系，还需要进一步的研究。