蔷薇科果实类药材脂肪酸不同样品前处理的GC-MS分析

杨 沫，况作品，方文韬，谢晓梅

(1.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学药学院 现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

中药中的有机酸是发挥临床疗效的重要活性成分[1-2]，主要包括脂肪酸、酚酸和萜酸等。文献调研发现，酚酸和萜酸类的分析检测采用常规的反相高效液相色谱法[3-6]，而脂肪酸则更适合采用气相色谱法，特别是气相色谱-质谱联用法(gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS)[7-8]。采用气相色谱法检测分析中药中脂肪酸时，由于受到实验温度下脂肪酸难以气化的局限，所以一般需要对脂肪酸进行衍生化处理。中药样品中脂肪酸衍生化应用较为广泛的是甲酯化法，主要有酸处理法、碱处理法、三氟化硼法等，优缺点各异[9-12]。在文献报道的甲酯化处理法中，有将样品粉碎后直接加入甲酯化试剂进行衍生化[13-14]；也有先提取样品中脂肪酸成分，再加甲酯化试剂至提取物中进行甲酯化[15-16]。不同样品状态下的甲酯化对中药脂肪酸分析有何影响鲜见报道。本研究考察了2015年版《中华人民共和国药典》(一部)收载的5种蔷薇科果实类“味酸”药材(木瓜、乌梅、山楂、覆盆子和金樱子)，采用直接甲酯化和不同浓度乙醇提取后再甲酯化的供试品溶液制备方式，利用GC-MS同时测定多种脂肪酸，旨在为GC-MS测定中药脂肪酸的样品前处理选择提供科学依据，同时也为5种药材的脂肪酸表征和比较提供实验资料。

1 仪器与试药

1.1 仪器 7890B/5977A气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；BP211D电子天平：德国赛多利斯公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Milli-Q Advantage超纯水机：美国Millipore公司；氦气(载气，纯度>99.999%)。

1.2 试药 所测药材样品均购自安徽省亳州药材市场，经安徽中医药大学周建理教授鉴定基原为蔷薇科植物果实木瓜[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai]、乌梅[Prunusmume(Sieb.) Sieb. et Zucc.]、山楂(CrataeguspinnatifidaBge. var. major N. E. Br.)、覆盆子(RubuschinginHu)和金樱子(RosalaevigataMichx.)。药材经60 ℃干燥后粉粹(过40 目筛)备用。所用试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 仪器条件 参考文献[16]并通过条件优化建立本方法。色谱条件：HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；气化室温度280 ℃；柱温：程序升温，初始温度40 ℃，保持3 min，40 ℃升至192 ℃(每分钟4 ℃)，保持7 min，192 ℃升至280 ℃(每分钟4 ℃)，保持5 min；分流进样，分流比10∶1；进样量1 μL；载气：氦气；流速：1 mL/min。质谱条件：EI源，电离能量70 eV，温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；发射电流100 mA；检测电压1.1 kV；检测增益11.2；传输线温度280 ℃；扫描质量范围：40～450 amu。溶剂延迟时间为2.9 min。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 直接甲酯化 参照文献[17]并作优化调整。取供试品粉末1.0 g，精密称定；置50 mL试管中，加入H2SO4-CH3OH(1∶10)溶液20 mL，密闭，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，60 ℃恒温水浴24 h；冷却至室温，上清液定量转移至盛有20 mL水的分液漏斗中，再精密加入20 mL CH2Cl2，充分振荡后静置2 h，收集CH2Cl2层，经饱和NaCl溶液洗涤后加5 g无水Na2SO4脱水，滤液即为供试品甲酯化溶液Ⅰ。

2.2.2 提取后甲酯化 参照文献[15]并作优化调整。取供试品粉末2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入90%、50%乙醇溶液各40 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，滤过，滤液蒸干；残渣加水20 mL，用1 mol/L NaOH溶液调pH至11.0，加入等容积石油醚并充分振荡；取水层，用1 mol/L HCl溶液调pH至2.0，分别加入等容积乙酸乙酯、正丁醇萃取，有机相减压回收溶剂；加H2SO4-CH3OH(1∶10)溶液20 mL置残渣中，按“2.2.1”项下方法得供试品甲酯化溶液Ⅱ、Ⅲ。

2.3 供试品溶液的测定 取“2.2”项下制备的5种供试品各甲酯化溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，按“2.1”项下条件进样分析，得各药材3种甲酯化溶液GC-MS总离子流图(见图1)。采用NIST11数据库对各甲酯化溶液Ⅰ的总离子流图进行谱库检索，依据相似度匹配并参考文献，对相对面积大于0.1%的峰进行成分辨识；利用面积归一化法计算各峰相对含量。5种药材主要脂肪酸成分测定结果见表1。

3 讨论

HP-5MS弹性石英毛细管采用非极性的(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷固定相，组分按照沸点高低依序出峰，一般小分子沸点低，保留时间短，分子量增大保留时间延长。通过对蔷薇科5种果实类药材粉末直接甲酯化和经提取后提取物甲酯化的不同样品前处理方式比较，发现检测结果显示出较大的差异。由图1(AⅠ—EⅠ)可见，直接甲酯化可检测出种类更多的脂肪酸，包括短链和长链脂肪酸(C2—C24)。而提取后甲酯化的检测结果与提取溶剂的极性大小有关，极性大有利于表征短链脂肪酸，如50%乙醇提取利于苹果酸、柠檬酸等小分子多元酸(图1中AⅢ—EⅢ)检测；极性小有利于表征长链脂肪酸，如90%乙醇提取利于油酸、亚油酸等高级脂肪酸(图1中AⅡ—EⅡ)的检测；5种药材基本呈现同样现象，显示供试品制备方式对甲酯化检测脂肪酸影响的规律性。鉴于溶剂极性对检测结果的影响，实验中对提取物衍生化反应产物的提取也分别选择了正丁醇和乙酸乙酯两种不同极性的溶剂。为了便于显示不同甲酯化方式对脂肪酸检测的影响，本研究对总离子流图纵坐标示值作了归一化处理。

注：Ⅰ.直接甲酯化；Ⅱ. 90%乙醇提取后甲酯化；Ⅲ. 50 %乙醇提取后甲酯化

图1木瓜(A)、乌梅(B)、山楂(C)、覆盆子(D)和金樱子(E)3种甲酯化方式的GC-MS总离子流图

对能反映较多脂肪酸信息的直接甲酯化方式检测图进行成分和相对含量分析，表1可见 5种药材含脂肪酸种类和含量存在明显差异，在种类上从大至小的顺序为木瓜(相对含量大于0.10%有27种)、山楂(相对含量大于0.12%有19种)、金樱子(相对含量大于0.13%有16种)、乌梅(相对含量大于0.20%有12种)、覆盆子(相对含量大于0.16%有12种)；5种蔷薇科果实类药材共有成分为苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等短链多元脂肪酸以及油酸、亚油酸和硬脂酸等高级脂肪酸；对于水溶性短链脂肪酸检测结果与课题组前期HPLC分析结果趋势基本相同，木瓜、乌梅和山楂富含苹果酸或柠檬酸，而覆盆子和金樱子各有机酸含量均较低[18]。值得一提的是本方法未能检测到在5种药材中较多存在的脂环族水溶性有机酸——莽草酸和奎宁酸。

实验中发现脂肪酸成分的检测结果除了与衍生化方法、衍生化条件参数以及本实验考察的在相同衍生化方法中样品不同物理状态有关外，还与分析参数有关，如色谱柱程序升温中初始温度和升温速度的设定以及质谱的扫描质量范围；特别是初始温度设定较高时不利于检测到短链脂肪酸，如苹果酸；程序升温速度较快时不利于性质相似组分的分离，如亚油酸和油酸。

表1 蔷薇科5种果实类药材主要脂肪酸成分相对含量测定结果

综上，在相同的气相色谱分离检测条件下，不同样品前处理方法对脂肪酸的检测结果存在明显差异。采用超声波辅助H2SO4-CH3OH溶液一步提取衍生化(药材粉末直接甲酯化)可较全面地同时了解短链和长链脂肪酸成分的种类信息，是GC-MS测定中草药脂肪酸方便快捷的甲酯化方法。